水稻秈、粳花粉源基因飄流的競爭性

趙建發 何光亮 何美丹 柯智 翟楠鑫 符亞小寧 裴新梧 袁潛華

（1. 海南大學熱帶農林學院，海口 570228；2. 中國農業科學院生物技術研究所 農業部轉基因安全評價重點實驗室，北京 100081）

水稻（Oryza sativaL.）是世界上最重要的糧食作物之一，為亞洲半數以上人口的主食，在人類經濟、文化發展過程中起到了非常重要的作用。水稻種植過程中容易受到諸多病、蟲及草害等危害。為保證種植作物穩產和高產的前提，提高作物品質，增加經濟收益，人們試圖將生物技術與作物遺傳改良相結合，通過提高水稻抗性的方式來提高水稻產量。近年來，研究人員培育出一大批品質優良，遺傳穩定的轉基因作物，在給農業帶來巨大的社會效益和經濟效益的同時，其生態安全性和食品安全性也備受關注［1］，這也是目前轉基因水稻還未商業化的主要因素。因此在田間條件下進行轉基因水稻生態安全風險評估已成為目前研究的重點，而研究轉基因水稻的基因飄流是其生態安全評估的主要內容之一［2-3］。

基因飄流是指同種或異種有性可交配物種之間通過風媒或蟲媒、風媒加蟲媒及供體的花粉擴散到受體植物的柱頭上授粉、受精結實的過程，簡稱由花粉擴散介導基因飄流［4］。不同類型的水稻花粉導致基因飄流差異較大，近10多年來，國內外以轉基因水稻作為花粉供體，以栽培稻、普通野生稻、不育系等作為受體，采用長方形或同心圓田間試驗設計進行大量試驗，闡明了不同類型的水稻基因飄流的基本規律，并建立了可預測水稻轉基因飄流的高斯煙羽模型［5］。研究結果表明，水稻作為自花授粉植物，天然異交結實率低，一般小于1%［6-7］，轉基因水稻與非轉基因水稻相鄰種植時，供體向不育系的基因飄流率最高，為1.556%（培矮64S）-80.100%（中9A），平均為46.25%。向普通栽培稻的最大基因飄流率＜1%，平均為0.33%［8］。向普通野生稻的基因飄流率介于不育系和常規稻之間，為11.24%-18.00%［4］。同時轉基因水稻也可以向紅稻和雜草稻進行基因飄流，向雜草稻和紅稻的基因飄流率小于 1%［9-11］。

栽培稻在遺傳上可分為兩個亞種，即秈亞種和粳亞種，由于兩個亞種的開花習性和異交結實特性有差異，因而作為花粉源的不同亞種基因飄流存在差異。基因飄流影響因子包括水稻花粉擴散能力或競爭力、受體的異交結實能力等。因此，研究基因飄流并準確建立基因飄流模型需要分析水稻花粉競爭力。水稻花粉競爭力包括數量競爭力與遺傳競爭力，數量競爭力是當兩個供體的遺傳背景相同時，因花粉數量不同引起的對基因飄流率的數值影響，遺傳競爭力是當兩個供體的花粉數量相同時，因供/受體的遺傳親和力不同所造成的對基因飄流率的數值影響。研究表明，在同等數量條件下，粳型轉基因水稻B2與秈型轉基因水稻B9向不育系博A的基因飄流存在一定差異，表現為在同一距離上兩者的基因飄流頻率差異極顯著（P＜0.01）。當受體為不育系時，無論花粉源是秈型還是粳型轉基因水稻，在不同距離點的基因飄流頻率均為粳型＞秈型［12］。此外，在雜交水稻的制種實踐中，父母本行比是影響雜交水稻制種產量的重要因素，隨行比數量增加，供體花粉量增加，制種產量增加［13-14］，這意味著花粉源數量或源強大小影響受體的異交結實率。因此，在研究基因飄流時，除了要考慮花粉源的秈、粳類型之外，還需要研究花粉供體數量或源強大小對基因飄流的影響。

以往的研究大多只研究了一種花粉供體向不同受體的基因飄流率及差異，即使有個別研究不同水稻亞種類型的基因飄流差異的例子，也沒有考慮兩者之間的數量關系對基因飄流的共同影響。另一方面，過去的研究只考慮水稻供體與受體之間的數量競爭性，忽略了不同水稻供體之間對受體的競爭性，更沒有考慮花粉源數量競爭性和遺傳競爭性的相互作用對基因飄流的影響。鑒于此，為了研究秈稻與粳稻的遺傳競爭性與花粉源數量配比對基因飄流的影響，我們設計秈、粳雙供體在不同行比的條件下的基因飄流的試驗，試圖解析轉基因水稻花粉源的在基因飄流中的數量競爭性和遺傳競爭性。水稻的基因飄流率受到花粉競爭力的影響，它應該是改善水稻基因飄流模型精度的重要途徑。但到目前為止，有關轉基因水稻花粉的數量競爭和遺傳競爭的研究尚未見報道。開展對轉基因水稻花粉競爭力的研究，對進一步探討水稻基因飄流變化規律、認識和優化水稻轉基因飄流模型具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

花粉供體：轉基因水稻為粳稻B2和秈稻Bar9311（代號B9）；常規稻為粳稻秀水63（代號XS63）和秈稻9311。花粉受體為不育系博A。

B9為含bar基因抗除草劑的轉基因秈稻品系（Oryza sativaL. cv. Indica），該品系是由轉基因抗除草劑恢復系Bar68-1與9311經過雜交并多次回交獲得的穩定株系材料［15］。

B2為含bar基因的抗BastaR轉基因品種（Oryza salivaL.cv. Japonica），由中國水稻研究所利用基因槍法將bar基因導入到常規粳稻京引119中獲得轉bar基因粳稻植株T京引119［16］，然后將其與常規粳稻秀水63雜交獲得B2植株［17］。

1.2 方法

1.2.1 田間布局 本試驗于2016年12月于海南省樂東縣海南大學尖峰基地進行，試驗地位于東經108°46′12″，北緯 18°38′39″，試驗區域平坦開闊，水稻種植的行向和盛行風向垂直。水稻播種后采用濕潤育秧，按要求人工移栽，移栽規格20 cm×20 cm。

為了研究花粉競爭性，本試驗將轉基因水稻和常規稻4種按照“轉基因+非轉基因”雙供體組合配比設置花粉源，檢測其基因飄流。轉基因與非轉基因的花粉源配比可以通過檢測確定受體（不育系）接受的花粉來自哪一個供體。花粉源組合包括B9（秈，轉基因）+9311（秈）、B9（秈）+XS63（粳）、B2（粳，轉基因）+9311（秈）、B2（粳）+XS63（粳）配對，每個花粉源組合均以 1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、9∶1的行比種植在相互隔離的小區中，田間布局為4 m×4 m的小區，共計有36個小區，供體與受體（不育系博A）相鄰種植，不同的小區用2 m高隔離布相互隔離（圖1）。根據不同的花粉供體、按照不同的行比來模擬小區中花粉的量的差異，通過不同小區轉基因與常規稻種植行比的變化和雙供體類型的變化，來模擬不同花粉量和秈、粳兩種亞種類型對基因飄流的影響。

圖1 花粉競爭對基因飄流影響試驗田間布局

1.2.2 田間管理及生育期觀測 根據預備試驗推測供體、受體的生育期，確保花期相遇。花期重疊天數至少5-7 d，并記錄水稻生長的播插期、始穗期、齊穗期、始花期、終花期及成熟收獲期等各個時期。花粉供體B9、9311、XS63、B2和受體的花期相遇良好，各材料花期重疊日數在10 d以上。收獲時，單個小區樣品混收，分成3份，作為轉基因檢測的3次重復。

1.2.3 田間樣品檢測 基因飄流試驗結束后，收獲全部種子并進行下一步田間檢測。樣本種子種植后在3葉期開始噴施BastaR除草劑，每周一次，共噴施3次，3次濃度為依次為500 mg/L、500 mg/L和800 mg/L。同時，種植供體和受體材料作為陽性和陰性對照。噴施后存活的種子采用PCR檢測，排除假陽性。按照Jia等［8］的統計公式，計算基因飄流頻率（%）：

2 結果

2.1 抗性苗的檢測

按照圖1種植的供、受體材料，抽穗開花后受體完成異交結實，成熟后收獲種子，另選秧地播種，待水稻秧苗長至3葉期，通過噴施3次除草劑BastaR，可直觀辨別檢測轉基因后代。主要表現為綠色成活抗性苗是轉基因后代，枯死苗為常規稻雜交后代。為避免抗BastaR苗的假陽性，隨機選取綠色抗性苗，采用CTAB法提取DNA進行分子生物學檢測［18］。PCR結果顯示綠色存活苗均含有bar基因，如圖2為bar基因條帶，1-22均有表達，排除了假陽性。

圖 2 轉基因水稻基因飄流后代抗除草劑苗PCR結果

2.2 相同亞種花粉供體基因飄流與行比的數量關系模擬

為研究不同行比下基因飄流的數量競爭性，試驗設計不同的行比比例，以不同行比種植在相互隔離的小區中，各小區單獨隔離，保證各小區花粉傳播的獨立性。轉基因與非轉基因種植呈比例變化。理論上講，相同亞種姊妹系的花粉競爭力相同，因此試驗設計B9+9311與B2+XS63相同亞種姊妹系作為數量競爭性的雙供體，以此研究不同行比競爭導致的基因飄流的差異。通過趨勢擬合發現基因飄流率與行比的關系可用公式函數來擬合（圖 3）。兩種花粉源組合 A（B9+9311）和 B（B2+XS63）的基因飄流與行比的關系擬合公式方程分別是（1）和（2）：

因此，基因飄流率與供體行比成S曲線關系，基因飄流隨供體行比增加，在轉基因行比數量較小的條件下，基因飄流率變化較小，隨轉基因水稻行比數量的增加，基因飄流率顯著增加；在行比數量達到一定值時，基因飄流率增加不明顯。

圖3 轉基因與非轉基因水稻雙供體行比與基因飄流率關系

轉基因與非轉基因行數相同，秈、秈配比（B9：9311）基因飄流比例接近1∶1；粳、粳配比（B2：XS63）基因飄流的比例大于1∶1。即秈型花粉源同亞種類型的行比數量相同，兩個供體之間基因飄流的競爭力差異不顯著。這從另一側面印證了相同秈亞種姊妹系花粉供體的競爭性基本相同。

2.3 秈、粳亞種花粉供體基因飄流的競爭性

不同類型的花粉供體基因飄流存在差異，通過不同花粉供體的亞種類型配置和行比配置，研究由不同供體導致的基因飄流差異，探究擬合水稻雙供體數量競爭性及遺傳競爭性曲線模型，分析基因飄流競爭性。表1是不同秈、粳兩個亞種雙供體在不同行比配置下的基因飄流率的平均數差異。由表1可知，組合A和D差異極顯著（P＜0.01），飄流率均 值 A（58.277 8）＞D（19.890 0）， 即（B9+9311）組合與（B2+9311）組合在相同秈型供體9311競爭的條件下，B9飄流率與B2飄流率存在顯著差異，即B9的競爭性大于B2；組合B和C差異顯著（P＜0.05），飄流率均值 B（61.390 0）＞C（40.434 4），即（B9+XS63）組合與（B2+XS63）組合在相同粳稻供體XS63的競爭條件下，B9飄流率與B2飄流率存在顯著差異，B9的競爭性大于B2。可見，轉基因秈稻的競爭性大于轉基因粳稻。

組合C和D差異顯著（P＜0.05），飄流率均值C（40.434 4）＞D（19.890 0）。（B2+XS63） 組 合 與（B2+9311）組合有相同的粳型轉基因供體B2，XS63和9311提供了各自小區的常規花粉競爭，C＞D說明D區中競爭花粉的能力更強，即9311的競爭性大于XS63。因此常規秈稻競爭性大于常規粳稻，即秈稻花粉的競爭性大于粳稻。

表1 不同供體組合的平均基因頻率比較

3 討論

本試驗結果表明，水稻花粉的競爭性包括數量競爭性和遺傳競爭性。當兩個供體的遺傳背景相同時，因水稻花粉量不同而引起的基因飄流的差異可稱之為數量競爭性。當兩個供體的遺傳背景不相同時，因異交結實不同引起的基因飄流的差異可稱為遺傳競爭性。同種類型的水稻不同種植比例下的基因飄流率隨著轉基因行比的增加而增大。秈、粳雙供體因兩個供體之間遺傳背景不同，其基因飄流率的變化既存在遺傳競爭性的差異，又存在數量競爭性的差異，不同種植比例下的基因飄流率應為兩種競爭性共同作用。前人只研究同一供體對不同受體的基因飄流，沒有研究不同供體的基因飄流競爭性。本試驗彌補了前人研究的不足。

3.1 轉基因水稻基因飄流的數量競爭性

在對水稻進行花粉競爭性研究時，在數量競爭性作用下，水稻相同亞種在不同行比配制下的基因飄流率呈S曲線關系。在轉基因行比數量較小的條件下，轉基因穎花數量少，受體接受花粉較少，因此基因飄流率變化較小；隨轉基因水稻行比數量的增加，穎花數量增加，受體接收花粉的數量顯著增加，基因飄流率顯著增加；在行比數量達到一定值時，穎花數量接近飽和，基因飄流率增加不明顯。同時，在雜交水稻的制種實踐中，父母本行比是影響雜交水稻制種產量的重要因素，隨行比數量增加，供體花粉量增加，制種產量增加［13-14］。因此，供體穎花數量是影響基因飄流數量競爭性的主要因素。秈、秈配比的基因飄流比例與粳、粳配比的基因飄流的比例都接近1∶1，在相同行比條件下，基因飄流率相同。即同種亞種類型配比，基因飄流的競爭差異不明顯，可視為具有同等基因飄流能力。

3.2 轉基因水稻基因飄流遺傳競爭性

在相同行比配置條件下，比較秈、粳兩種亞種的花粉競爭，結果表明秈稻與粳稻花粉競爭存在顯著差異，秈稻的競爭性大于粳稻。不同供體相同栽插行比的條件下，秈稻的競爭性大于粳稻。分析其原因，認為秈稻單株分蘗數量優于粳稻，秈稻的優勢主要是根系發達、分蘗能力強、穗大花粉量多［19］，導致秈稻單位面積的花粉數量大于粳稻，同等行比情況下秈稻花粉數量占據優勢。何美丹等［20］比較了兩組平行試驗中的秈、粳型轉基因水稻基因飄流差異，分別以秈型轉基因水稻B9和粳型轉基因水稻B2為花粉供體，秈型不育系博A為受體材料，受體中同期種植常規秈稻特秈占25作為競爭花粉源，在同等自然條件下研究秈、粳型轉基因水稻向不育系和常規稻的基因飄流頻率。結果表明，當受體為不育系時，無論花粉源是秈型還是粳型轉基因水稻，在不同距離點的基因飄流頻率均為粳型大于秈型。10 m試驗區內秈型轉基因水稻向不育系各點平均基因飄流頻率為1.325%-23.948%，粳型為3.906%-45.934%［12，20］。但我們注意到，該試驗在相鄰距離種植了與受體不育系BoA相同花期的秈型競爭花粉源特秈占25，且不育系BoA與常規稻特秈占25按插植行比3∶1相間種植，試驗中秈型花粉源的競爭性較大。另一方面，同為秈稻的花粉供體和競爭花粉源植株每日開花時間（花時）基本相同，秈稻比粳稻花時早而且持續時間較長，而秈、粳花時相遇時間較短［21］，這更是增加了對秈稻花粉源的競爭性。而在該試驗中粳稻轉基因花粉源并沒有來自同類型常規粳稻花粉的競爭，因而該試驗中兩組基因飄流結果相比較，其結論是在不同距離的取樣點粳稻的基因飄流頻率均大于秈稻。因此，在秈型花粉源競爭能力強大的情況下，不同距離點上粳稻基因飄流頻率大于秈稻是可以理解的。可見，在研究轉基因飄流的遺傳競爭過程中，數量競爭的影響是很大的，也許在一定條件下水稻的數量競爭占主導作用。

此外，研究遺傳競爭性需要基于秈、粳兩種亞種小區中的穎花數量完全相同的情況，單純計算兩個亞種的行比來確定遺傳競爭性，似乎包括了秈粳兩種花粉供體植株群體數量不同而導致的花粉數量競爭，這種競爭性是數量競爭與遺傳競爭共同作用的綜合結果，且在一定條件下水稻的數量競爭占主導作用。本研究的結論“在相同行比配置條件下，秈稻的競爭性大于粳稻”應該是數量競爭與遺傳競爭共同作用。另外，不同的研究結果比較還要考慮試驗季節、氣候類型和花期相遇程度等，有關結論有待進一步研究探討。

4 結論

水稻相同亞種的秈-秈與粳-粳雙供體組合的基因飄流頻率受數量競爭性的影響；秈-粳不同亞種雙供體的基因飄流頻率，受花粉源的數量競爭性和遺傳競爭性的共同影響。相同亞種花粉源組合的數量競爭性表現為基因飄流率與轉基因花粉供體行比呈S型曲線的關系；秈-粳花粉源組合在數量競爭與遺傳競爭共同作用下，秈稻基因飄流率大于粳稻，說明秈稻花粉競爭性強于粳稻。花粉數量競爭性和遺傳競爭性共同影響水稻的基因飄流。

致謝：本研究所使用的水稻材料B2由中國水稻研究所錢前博士提供，Bar9311由中國科學院亞熱帶農業生態研究所肖國櫻博士提供，謹致謝忱。