一株高產瓊膠酶海洋細菌的篩選與鑒定

周欽茂 謝燕純 陳彥梅 張揚 柯德森 陳瓊華

（廣州大學生命科學學院，廣州 510000）

瓊膠是從紅藻中提取的親水性海藻多糖，由瓊膠糖和硫瓊膠組成［1］。由于瓊膠具有優良的凝膠、增稠和穩定性能，常被用于制作增稠劑、凝固劑、保鮮劑等，廣泛應用于食品、日用化工、輕工、醫藥等領域中［2］；但是，由于瓊膠黏度高，水溶性差，難以被吸收，在應用方面也受到很大限制［3］。然而，由瓊膠水解得到的瓊膠寡糖（主要由瓊二糖的重復單位連接而成，分為瓊寡糖和新瓊寡糖兩個系列）卻具有水溶性高，易被吸收的特點，具備良好的抑菌、增殖腸道益生菌、抗腫瘤、抗炎、抗氧化、抗病毒、增強免疫、吸濕保濕、美白和對植物病害防治等藥理作用和生物活性，是一種新型海洋功能性低聚糖，已經成為國內外研究的熱點，具有極大的開發潛力［4-6］。目前利用瓊膠來獲得低分子量的瓊膠寡糖多采用生物酶法（瓊膠酶）和化學法（酸水解），其中化學法處理無法精確控制水解度，而且后期的分離純化過程非常繁瑣，還會導致生成的瓊膠寡糖喪失生物活性，具有很大的局限性；而生物酶法作用環境十分溫和，降解過程易控制，產物專一且易于分離純化，工藝環保高效［7-9］。因此，運用瓊膠酶降解瓊膠制備瓊膠寡糖已成為瓊膠工業高值化研究的重要方向。

瓊膠酶是能夠降解瓊膠的水解酶，分為α-瓊膠酶和β-瓊膠酶。α-瓊膠酶裂解瓊脂糖的 α-1，3糖苷鍵，生成以3，6-內醚-α-L半乳糖為還原性末端的的瓊寡糖系列；β-瓊膠酶裂解瓊脂糖的 β-1，4 糖苷鍵，生成以β- D-半乳糖為還原性末端的新瓊寡糖系列［10］。迄今為止，瓊膠酶主要通過海洋微生物獲得，因此，獲得具有開發前景的菌株是開發微生物瓊膠酶的前提，目前人們已經從海水系統中分離到了多種產瓊膠酶菌株，包括假單胞菌屬［11］（Pseudomonas）、假別單胞菌屬［12］（Pseudoalteromonsa）、鏈霉菌屬［13］（Streptomyces）、別單胞菌屬［14］（Alteromonas）、不動桿菌屬［15］（Acinetobacter）、弧菌屬［16］（Vibrio）和船蛆桿菌屬［17］（Teredinibacter）等。但是普遍存在的問題是這些菌株所產瓊膠酶活性低，多數報道的菌株產瓊膠酶活力在 10 U 以下，降解瓊膠能力普遍不高，遠未能達到工業化生產瓊膠寡糖的需求［18］。目前只有Sigma公司從大西洋假單胞菌中分離的β瓊膠酶應用于生產，且價格十分昂貴，應用范圍大多僅限于科研工作中，這嚴重阻礙了瓊膠酶及瓊膠寡糖的開發應用［19］。

廣東省擁有豐富的海藻資源，近年來海藻養殖方面也取得了很大進展，但在開發利用方面還比較薄弱，存在很大的資源利用空間。因此，本研究選擇富含瓊膠的海洋龍須菜做為瓊膠酶產生菌的分離對象，通過多種不同的篩選培養基，從龍須菜中分離產瓊膠酶菌株，并對得到的菌株進行形態學、生理生化、16S rRNA 基因序列分析及發酵產酶研究，旨在獲得瓊膠酶高產菌株，為瓊膠酶及瓊膠寡糖的開發利用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品 龍須菜樣品于2016年8月采自廣東省南澳島海域。

1.1.2 主要試劑和儀器 K2HPO4，KCl，MgSO4·7H2O，牛肉膏，酵母浸膏，海鹽，D半乳糖，碘化鉀，3-5二硝基水楊酸，酒石酸鉀鈉（上海生工生物工程有限公司），α-pNPG 和 β-pNPG（Macklin 公司）。

7230G紫外-可見分光光度計（上海諾科），SX-500高壓蒸汽滅菌鍋（Tomy公司），PB-10 pH計（Sartorius公司），BS423S天平（Sartorius公司），BCD-563WY-C對開門冰箱（Haier 公司），SW-CJ-2FD潔凈工作臺（Airtech公司），ETC 811 PCR儀（北京東勝創新生物科技有限公司），弧菌科細菌生化鑒定盒（廣東環凱微生物科技有限公司）。

1.1.3 培養基 x半海水培養基［20］（g/L）：蛋白胨6，瓊脂粉15，K2HPO41，KCL 0.5，MgSO4.7H2O 0.5，人工海水配制，pH 7.2左右；2216E培養基（g/L）：蛋白胨5，酵母膏1，瓊脂粉15，磷酸高鐵0.01，人工海水配制，pH 7.6-7.8；改良培養基［21］（g/L）：MgSO4.7H2O 0.1，FeSO40.1，（NH4）2SO42，K2HPO47，KH2PO43，瓊脂粉15，人工海水配制，pH 7.2；富集培養基（g/L）：瓊脂粉2，蛋白胨10，酵母膏10，NaCL 20，pH 6.5；斜面培養基：同x半海水培養基；種子培養基：蛋白胨6，瓊脂粉10，K2HPO41，KCL 0.5，MgSO4.7H2O 0.5，人工海水配制，pH 7.2左右；發酵培養基：同種子培養基。

1.2 方法

1.2.1 產瓊膠酶菌株分離和篩選 在廣東省南澳島采集龍須菜樣品，分別通過均質法和振蕩法處理樣品后，取懸液接入富集培養基進行富集培養，將富集培養的菌液進行 10-1-10-4逐級稀釋，取 10-3、10-4兩個稀釋度的菌液涂布平板，27℃恒溫培養18-24 h。用接種環挑取不同菌落進行平板分區劃線，重復操作直至得到純化菌株。滴加盧戈氏碘液，觀察是否產透明圈，以此判斷純化菌株是否產瓊膠酶。選取透明圈較大的菌株，挑取相應的菌苔3環，接入裝有60 mL 種子培養基的100 mL錐形瓶中，28℃、180 r/min 振蕩培養18 h后以3%的接種量接入裝有100 mL發酵培養基的500 mL錐形瓶中，28℃、180 r/min 振蕩培養24 h后以5 000 r/min 的轉速離心15 min，取上清液即粗酶液進行酶活力的測定。

1.2.2 瓊膠酶活力的測定 （1）標準曲線的制定：準確稱取100 mg 半乳糖，用少量蒸餾水溶解后轉移到100 mL 容量瓶定容，得到濃度為l mg/mL的半乳糖溶液。取9 支25 mL 具塞試管，按照表1內容加入試劑，混合均勻后沸水浴5 min，冷卻至室溫，將其定容到25 mL，隨后對混合液540 nm 處的吸光值進行測定，然后根據吸光值制作標準曲線。（2）DNS法測酶活：參照朱慧文、孫延娜等的方法［22］，采用DNS法測酶活：配制底物，加熱煮沸，待瓊脂全部溶解后取出置于50℃水浴鍋中緩慢降溫。將發酵液在5 000 r/min下離心20 min 后分別取粗酶液1 mL加入4支25 mL具塞試管中，1支作為空白對照組，另外3支為實驗重復組。在空白組中加入1.5 mL DNS溶液鈍化瓊膠酶，將全部試管置于50℃水浴鍋中水浴保溫10 min。各吸取底物溶液（0.3%瓊脂配制）1 mL，加入4根試管中，充分混勻后于50℃水浴鍋中反應30 min。DNS各1.5 mL，分別加入至實驗組的3根試管中以終止反應，50℃水浴保溫10 min。取出試管，沸水浴 5 min后立即冷卻至室溫，，用蒸餾水定容至25 mL，充分混勻后，于540 nm 處測吸光值。以煮沸滅活酶液為對照，用半乳糖制作標準曲線，根據標準曲線確定酶降解底物產生的還原糖的量。瓊膠酶的活力定義為：在上述反應條件下，1 mL酶液1 min產生l μg還原糖作為一個酶活力單位（U/mL）。

表1 半乳糖標準曲線的制作

瓊膠酶活力（U/mL）= 半乳糖含量（mg）×1 000×粗酶液（mL）×稀釋倍數 / 反應體系中酶液加入量（mL）×時間（min）

1.2.3 菌株的形態學觀察及生理生化鑒定 將菌株在平板培養基上劃線接種，采用肉眼觀察菌落形態，參照《常見細菌系統鑒定手冊》［23］進行染色，觀察菌體的單染色、革蘭氏染色、鞭毛染色、芽孢染色和莢膜染色等結果，利用弧菌科細菌生理生化鑒定盒（廣東環凱微生物科技有限公司）鑒定菌株的生理生化特性。

1.2.4 16S rRNA基因序列的基因序列擴增、比對和系統發育分析 采用煮沸處理法［24］對菌株進行破壁處理，使用通用引物27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和 1492R（5′-GGCTA CCTTGTTACGACTT-3′）進行菌落PCR。PCR擴增程序為 95℃ 2 min，94℃ 30s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，35個 循環；72℃ 10 min。將PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，送至上海生工生物工程有限公司測序。使用Geneious軟件對測序結果進行拼接，利用NCBI網站的BLAST程序在GenBank上對拼接結果進行相似性比對，分析比對結果，從比對結果中挑出相似性較高的菌株序列，使用 MEGA7.0的Neighbor-Joining（NJ）方法構建系統發育進化樹。

1.2.5 細菌生長曲線和產酶曲線的測定 以6%的接種量將種子液接種到發酵培養基，180 r/min，28℃搖床發酵培養，定期取適量發酵液測定600 nm下稀釋10倍的菌液的吸光度和發酵液的酶活力，繪制該菌的生長曲線和產酶曲線。

1.2.6 瓊膠酶類型的鑒定 參照Temuujin等［25］、馬芮萍和朱艷冰等［26］的方法，取400 μL 4 mg/mL的α-pNPG（對硝基苯基 -α-D-吡喃半乳糖苷）和 β-pNPG（對硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷）分別和1 mL 50 mmol/L的NaH2PO4-Na2HPO4緩沖液（pH 7.0）混合均勻，40℃水浴預熱5 min，迅速加入1 mL粗酶液，混勻后40℃水浴加熱反應1 h，加入1 mL 1 mol/L的Na2CO3終止反應，420 nm波長下測定吸光度。

2 結果

2.1 瓊膠酶產生菌的分離篩選

2.1.1 初篩結果 從采集到的龍須菜樣品中共分離到18株產瓊膠酶的海洋細菌。通過滴加盧戈氏碘液觀察透明圈大小，測量比較透明圈內外徑大小進行初篩，得到8株產瓊膠酶能力較強的菌株。圖1是其中編號為D-5的菌株的盧戈氏碘液染色圖片，其菌落周圍形成較大的透明水解圈，說明該菌株具有較強的瓊膠降解能力。

圖1 菌株D-5在瓊脂平板上的碘液染色結果

2.1.2 復篩結果 將初篩得到的8個菌株搖瓶發酵培養48 h，分別測定其發酵液的瓊膠酶活力，測定結果見表2。由復篩結果可知，編號D-5的菌株酶活最高，故確定D-5為研究對象，將其命名為ZQM2017。

表2 復篩酶活對比

2.2 16S rRNA基因序列分析及系統發育樹構建

如圖2所示，將PCR 擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳，在大約1 500 bp處得到一條單一、明亮的條帶。將PCR產物送至上海生工生物工程有限公司測序，拼接得到 1 453個堿基序列，將序列提交到GenBank數據庫，獲得登錄號為MG772935。將測序所得基因序列在NCBI上通過BLAST與 GenBank 數據庫的序列進行比對，菌株ZQM2017的16S rRNA 基因序 列 與Vibrio alginolyticus、Vibrio natriegens、Vibrio azureus、Vibrio azureus和Vibrio parahaemolyticus等細菌的序列相似性達到99%，將這些相似性較高的序列，通過MEGA7.0軟件構建系統發育樹，結果如圖3。

菌株ZQM2017的16S rRNA序列與NCBI數據庫中52株弧菌（Vibrio）的16S rRNA序列相似度達到99%，可以鑒定ZQM2017為一株弧菌，但由于ZQM2017與這些菌株的相似性過高導致構建出的系統發育樹的bootstrap太小，仍需結合形態學和生理生化指標將ZQM2017鑒定到種。

圖2 菌株ZQM2017 16S rRNA PCR產物電泳圖譜

2.3 菌株的形態學觀察及生理生化鑒定

菌株平板分區劃線結果和單染色鏡檢結果如圖4所示：該菌形成的菌落小，直徑0.43-1.56 mm不等，圓形，乳白色，邊緣整齊，質地濕潤黏稠，表面光滑，可被挑起，不透明。點接培養24 h后滴加盧戈氏碘液染色，測量得到透明圈內徑（菌落直徑）約為3.6 mm，外徑（透明圈直徑）12.23-15.89 mm。

圖3 菌株ZQM2017系統進化樹

圖4 菌株ZQM2017形態學特征

挑取少量菌苔染色制片，單染色結果顯示該菌為短桿狀；革蘭氏染色結果顯示菌體呈紅色，判斷為革蘭氏陰性（G-）細菌；鞭毛染色結果顯示該菌為周生鞭毛；莢膜染色結果顯示該菌無莢膜；芽孢染色結果顯示該菌無芽孢。使用弧菌科細菌生化鑒定盒，經培養觀察，得到ZQM2017和弧菌科常見菌種的部分生理生化指標對照表（表3）。菌株ZQM2017的部分生理生化指標和溶藻弧菌基本相符，結合形態學特征和16S rRNA序列比對結果，可將該菌鑒定為一株溶藻弧菌，命名為Vibrio alginolyticusZQM2017。

2.4 標準曲線的繪制

半乳糖濃度在0-1.6 mg范圍內，含量和反應液在540 nm處的吸光值具有良好的線性關系，線性方程為y=0.521 8x-0.025（圖5）。

2.5 菌株生長曲線和產酶曲線

由圖6可以看出，菌株Vibrio alginolyticusZQM-2017延滯期較短，在3 h時已經結束延滯期；3-9 h屬于對數生長期，在該時期內生物量快速增加，相應的酶活逐步上升；在9-35 h期間，該菌生物量開始下降且相對穩定，進入相對穩定期，相應酶活仍保持持續上升；在35 h以后，該菌生物量總體呈下降趨勢，可以判斷為衰亡期；在46 h時，生物量最低，相應的酶活卻達到最大值為109.87 U/mL，在46 h以后酶活開始下降。

表3 Vibrio sp. ZQM2017與相近弧菌屬的生理生化特征

圖5 半乳糖標準曲線圖

出現酶活峰值可能是因為在46 h時，生物量最低，細菌裂解量達到最大，胞內酶釋放，增加了粗酶液的酶活，使得總體酶活達到最大。在46 h以后，菌體裂解量增大，胞內有機酸釋放，代謝產物不斷累積，導致酶活受到抑制，酶活性大小呈下降趨勢。由此可判斷，該菌株最佳發酵時間為46 h。

圖6 菌株ZQM2017生長曲線和產酶曲線

2.6 瓊膠酶類型的鑒定

利用Vibrio alginolyticusZQM2017菌株發酵所得的粗酶液分別與α-pNPG和β-pNPG反應1 h，測定OD420，結果顯示，粗酶液和α-pNPG反應后測得OD420為0.145，粗酶液和β-pNPG反應后測得OD420為0.136。實驗結果表明，菌株Vibrio alginolyticusZQM2017所產瓊膠酶為混合型，同時含α-瓊膠酶和β-瓊膠酶，且前者含量略高于后者，可以水解瓊膠得到瓊寡糖和新瓊寡糖。

3 討論

利用瓊膠酶水解瓊膠得到新型海洋功能性低聚糖——瓊膠寡糖是開拓海藻深加工及瓊膠寡糖開發利用的重要途徑，目前已成為國內外研究的熱點。分離篩選產瓊膠酶的微生物是獲取瓊膠酶的主要方法，但目前分離得到的微生物所產瓊膠酶活力普遍不高，遠未能滿足工業化生產瓊膠寡糖的要求。如2014年，馬芮萍等［27］分離的Stenotrophomonassp.NTa.，優化后的發酵酶活僅為1.98 U/mL；2014年，劉麗莉等［28］分離的新型產瓊膠酶海洋菌株Vibrio agarivoransZGR-26所產酶活為32.1 U/mL；2016年，曾誠［29］分離的Thalassospirasp.fst-13007，發酵酶活最大僅達到2.76 U/mL；2016年，張林林等［30］分離的編號為A-001的海洋貝類腸道瓊膠降解菌株，酶活達到13.01 U/mL；2017年，張建美等［31］對分離到的產瓊膠酶弧菌Ag-1進行發酵優化，得到最高酶活為45.51 U/mL。迄今只有Sigma-Aldrich有限公司從大西洋假單胞菌（Pseudomonasatlantica）中分離的β瓊膠酶應用于生產，且價格十分昂貴，純度大于 5 000 U/mg 的產品，1 kU包裝的價格為 1 854.45元人民幣，目前應用范圍僅限于科研工作中，這嚴重阻礙瓊膠酶及瓊膠寡糖、瓊膠低聚糖的開發應用。

本研究篩選得到的海洋細菌Vibrio alginolyticusZQM2017在相同培養條件下的產酶能力處于較高水平，具有極大的開發潛力。若要進一步提高菌株Vibrio alginolyticusZQM2017的產酶能力，可對該菌株進行多方面如碳源、氮源、接種量、接種時間和酶解溫度等條件的綜合優化，這將是后續實驗開展的方向。相信經過進一步優化，菌株Vibrio alginolyticusZQM2017的產酶能力會大大提高，為瓊膠寡糖的開發利用奠定扎實的基礎。

4 結論

本研究從廣東省南澳島海域采集到的龍須菜（Gracilaria lemaneiformis）上分離得到18株瓊膠酶產生菌，從中篩選得到1株酶活最高的瓊膠酶產生菌ZQM2017。通過形態學特征、生理生化特性和分子鑒定等手段，確定ZQM2017是一株溶藻弧菌。利用底物顯色法鑒定得到，該菌所產瓊膠酶為混合酶，同時含有α-瓊膠酶和β-瓊膠酶，且前者含量略高于后者。通過初步優化測酶活方法，測定該菌的產酶曲線、生長曲線和pH曲線，初步了解該菌的生長特點，得到最佳發酵時間為46 h，初始酶活最高可達109.87 U/mL。