蜚蠊腸道抗真菌活性放線菌的篩選與鑒定

曾還雄 方霞 劉凌燕 金小寶

（廣東藥科大學基礎學院 廣東省生物活性藥物研究重點實驗室，廣州 510006）

美洲大蠊是中國傳統中藥材蜚蠊的代表性蟲種，是一種世界性衛生害蟲，可長期自由生活在污水管道和化糞池等充滿大量病原微生物的環境中，具有超強的繁殖力和抗病能力，這可能與其腸道內存在大量正常菌群有很大關系［1-2］。湯歷等［3］從德國小蠊腸道分離得到具有抗真菌活性的內生細菌，美洲大蠊和德國小蠊生活環境和生活習性相近似，提示美洲大蠊腸道也可能存在具有抗真菌活性的內生菌群。本課題組前期從蜚蠊（美洲大蠊）腸道分離得到159 株放線菌［4］，本文擬以白色念珠菌（Candida albicansATCC10231）、紅色毛癬菌（Trichophyton rubrumATCC60836）、黑曲霉（Aspergillus nigerATCC16404）和煙曲霉（Aspergillus fumigatusATCC96918）4 種人體常見致病真菌為研究對象，采用牛津杯法和菌株對峙共培養法對這159 株腸道內生放線菌進行體外抗真菌活性篩選，并采用分子生物學方法對目標菌株進行分類鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 放線菌來源和供試病原真菌 159株受試放線菌均為課題組前期從蜚蠊腸道分離得到［4］，-80℃甘油保存。供試病原真菌：白色念珠菌（Candida albicansATCC10231）、紅色毛癬菌（Trichophyton rubrumATCC60836）、黑曲霉（Aspergillus nigerATCC-16404）和煙曲霉（Aspergillus fumigatusATCC96918）等人體常見致病真菌均購自廣東省微生物研究所。

1.1.2 主要試劑與儀器 Ezup柱式細菌基因組DNA抽取試劑盒和PCR相關試劑為上海生物工程股份有限公司產品，各種培養基成分和其他試劑均為國產分析純。臺式高速冷凍離心機為德國Eppendorf 公司產品，PCR儀、電泳儀、電泳槽和GelDoc 凝膠成像系統均為美國Bio-Rad 公司產品。

1.2 方法

1.2.1 蜚蠊腸道159 株內生放線菌的抗真菌活性篩選 分別挑取各放線菌單菌落接種于發酵培養基，220 r/min、28℃條件下培養5-7 d，收集發酵液4 000 r/min 離心 30 min，取上清液備用［5］。采用牛津杯法［6］檢測各菌株發酵液抗白色念球菌活性：將高壓滅菌的PDA培養基自然冷卻到45℃左右，加入適量新鮮制備的白色念珠菌混懸液，混勻后，采用雙層倒板法均勻倒入平板上使白色念珠菌菌懸液終濃度為3-5×106CFU/mL。待培養基冷卻后，將牛津杯均勻放在平板上，分別加入200 μL不同菌株的發酵液上清，等量液體空白培養基作為空白對照。28℃培養3-5 d后，觀察抑菌作用情況。采用菌株對峙共培養法［7］檢測各菌株發酵液抗紅色毛癬菌、黑曲霉、煙曲霉等真菌活性：分別將受試放線菌接種到經高壓滅菌的PDA固體培養基的邊緣，28℃條件下培養，待其在PDA固體培養基上產生足夠量的孢子后，分別將受試真菌點接到培養基中央作為實驗組，空白對照組不接種受試放線菌，28℃培養4-6 d后，觀察抗真菌情況。所有實驗重復3次。

1.2.2 采用16S rDNA PCR對具有抗真菌活性菌株進行分子生物學鑒定 制備具有抗真菌活性的蜚蠊腸道內生放線菌基因組DNA，具體方法參照上海生物工程股份有限公司Ezup 柱式細菌基因組DNA抽取試劑盒說明書進行。PCR擴增各菌株16S rDNA基因采用通用引物［8］，正向引物 27 f為AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG，反向引物1492 r為TAC GGC TAC CTT GTT ACG ACT T。25 μL PCR 反 應 體系 ：Master mix 12.5 μL，正向、反向引物各1.0 μL，模板1.0 μL，ddH2O 9.5 μL。反應條件 ：95℃ 5 min ；94℃30 s，56℃ 30 s，72℃ 30 s，共 30個循環 ；72℃ 5 min。PCR產物進行1.5%的瓊脂糖凝膠電泳進行分析檢測后，委托上海生物工程有限公司進行基因測序。

1.2.3 具有抗真菌活性菌株16S rDNA同源性比對和系統發育樹分析 具有抗真菌活性菌株16S rDNA PCR產物經測序后，將各菌株的16S rDNA基因序列結果提交至NCBI在線數據庫，應用Blast程序和DNAMAN 6.0軟件進行同源性比對分析。并運用MEGA 5.2軟件采用Neighbor Joining方法構建系統發育樹，根據菌株間的親緣關系確定各菌株種屬分類情況［9］。

2 結果

2.1 抗真菌活性內生放線菌的篩選結果

159 株內生放線菌中有45 株內生放線菌對4 種真菌表現出不同程度的抑制作用，其中，對黑曲霉有抑制作用的內生放線菌有41 株，其次抗煙曲霉的為35 株，31 株對紅色毛癬菌有抑制作用，對白色念珠菌有抑制作用的內生放線菌最少，為23 株。具抗真菌活性的45 株內生放線菌中，10 株內生放線菌對4 種真菌均有拮抗作用，分別是WA-1-19、WA-2-4、WA-2-5、WA2-7、WA-4-31、WA-8-44、WA11-1-1、WA11-1-3、WA12-1-13 和 WA23-4-4。實驗結果見圖1、表1和表2。

表1 具有抗真菌活性的45株蜚蠊腸道內生放線菌的抗真菌情況

圖1 部分蜚蠊腸道內生放線菌體外抗真菌活性篩選實驗結果

2.2 抗真菌活性菌株分子生物學鑒定、同源性比對和系統發育樹

將各菌株16S rDNA基因序列利用NCBI在線數據庫，經Blast程序、DNAMAN 6.0軟件和MEGA 5.2軟件進行同源性比對以及系統發育樹分析。結果（表2，圖2）發現，共有45 株放線菌具有不同程度的抗真菌活性，分屬于8 個種屬。其中，鏈霉菌屬為優勢菌屬有32 株，占71.11 %；其次，戈登氏菌屬有6 株，微桿菌屬有2 株，分枝桿菌屬、無色桿菌屬、小單孢菌屬、纖維微菌屬和壤霉菌屬各有1 株。

表2 具有抗真菌活性的45株蜚蠊腸道放線菌的分布情況

圖2 10株對4種真菌均具有抑制活性放線菌的16S rDNA基因序列系統發育樹

3 討論

近年來，真菌感染日趨嚴重，特別是深部真菌感染明顯上升，已成為癌癥、艾滋病等患者主要死亡原因之一，真菌藥物研發是全球新藥研發的熱點之一［10］。昆蟲腸道放線菌是一類特境微生物，在長期共生和協同進化過程中，可產生生物活性物質保護宿主防御外來病原菌感染［11］。美洲大蠊生命力非常頑強，存在地球已達3.5億年之久［12］。美洲大蠊特殊的生活環境可能會使得其腸道內生放線菌在種類和功能上具有豐富的多樣性，也許是良好的藥用微生物資源。

放線菌，尤其是其中的鏈霉菌屬，是臨床抗菌藥物的主要來源［13］。本研究發現159 株蜚蠊腸道內生放線菌中有45 株對白色念珠菌、紅色毛癬菌、黑曲霉、煙曲霉等人體常見致病真菌具有拮抗作用，這些菌株隸屬于鏈霉菌屬、戈登氏菌屬、微桿菌屬、分枝桿菌屬、無色桿菌屬、小單胞菌屬、纖維微菌屬、壤霉菌屬等8個種屬。其中鏈霉菌屬32株，占比達71.11 %，為優勢菌屬；鏈霉菌屬是至今放線菌中種類最多、數量最大的一個屬，是一類具有重要藥用價值的微生物，早期發現的抗生素絕大多數是由該屬的菌種產生，如抗細菌抗生素鏈霉素、紅霉素、氯霉素、四環素等，抗真菌抗生素灰黃霉素、抗霉素等［14-15］。而且這些內生放線菌的抗真菌譜非常廣，其中，對黑曲霉具有抑制作用的內生放線菌有41 株，對煙曲霉、紅色毛癬菌和白色念球菌具有抑制作用的菌株分別為35、31和23株。更有意義的是，菌 株 WA-1-19、WA-2-4、WA-2-5、WA2-7、WA-4-31、WA-8-44、WA11-1-1、WA11-1-3、WA12-1-13 和WA23-4-4等10株內生放線菌同時對白色念珠菌、紅色毛癬菌、黑曲霉、煙曲霉等4種致病真菌均有較強的拮抗作用。推測這些放線菌，特別是其中的鏈霉菌屬可產生具有抗真菌活性的天然物質，從而有助于美洲大蠊抵御外來病原真菌的侵入和定植。下一步，我們擬采用生物活性追蹤和化學分離相結合等技術方法分離抗真菌化合物，研究這些放線菌株抗真菌活性物質基礎。

4 結論

本研究發現159 株蜚蠊腸道內生放線菌中有45株具有抗真菌活性，諸多菌株抗真菌譜較廣，有10株內生放線菌對4 種受試真菌均有拮抗作用。45 株具有抗真菌活性的菌株分屬于8 個種屬，提示蜚蠊腸道含有豐富的抗真菌活性放線菌資源。