釀酒酵母BJ3505 NHX1基因突變株的構建及功能驗證

王立光 陳軍 葉春雷 羅俊杰

（甘肅省農業(yè)科學院生物技術研究所，蘭州 730070）

釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）作為第一個完成基因組測序的真核生物［1］，在現(xiàn)代分子生物學中作為重要的真核模式生物，具有重要的科研應用價值。釀酒酵母具有穩(wěn)定的單倍體和二倍體細胞，基因組小，生命周期短，繁殖迅速，再加上其大部分基因功能都已得到驗證且又與植物和動物細胞具有很多相同結構，因此往往被用于基因功能鑒定。理論上，和酵母任何一種遺傳學特征相對應的不同生物的結構基因都能通過互補作用在釀酒酵母缺失突變體內得到鑒定［2-5］。單細胞真核生物釀酒酵母作為一種在實驗系統(tǒng)研究方面具有許多內在優(yōu)勢的模式生物，為高等真核生物提供一個檢測系統(tǒng)。

Na+，K+/H+反向轉運體（Na+，K+/H+exchanger，NHXs）是一類跨膜反向轉運蛋白，屬于一價陽離子 /H+反向轉運體（Cation/proton antiporter，CPA）基因家族中的CPA1亞家族，它們的生化活力是將Na+或K+與質子（H+）進行跨膜反向轉運［6-8］。NHXs在細菌、酵母、植物和動物等生物體內廣泛存在，并且一般具有多個家族成員，其在逆境響應、膜微囊運輸、蛋白存儲、細胞生長、pH調節(jié)、滲透調節(jié)、離子平衡及生長發(fā)育等生理生化過程中起著重要的作用［9-15］。根據(jù)進化分析和亞細胞定位，一般將NHXs分為三類：一類是定位于質膜上的成員，如擬南芥和胡楊的AtNHX7/SOS1、AtNHX8、PeSOS1；一類為定位于液胞膜上的成員，如擬南芥的AtNHX1-4；還有一類是定位于內膜（EndosomalNHXs）上的成員，如擬南芥和番茄的 AtNHX5-6、LeNHX2［6，9-11］。模式植物擬南芥中質膜上的AtNHX7/SOS1的作用及機制研究的比較清楚，液胞膜上的4個反向轉運體在抗逆中的作用也得到了廣泛研究，而內膜成員的研究近幾年才獲得實質性的進展［16-26］。人們通過轉基因技術，將獲得鑒定的NHX基因轉到作物及樹木中，得到了抗鹽、抗旱及高產的改良品種［27-35］。因此，鑒定檢測新的NHX基因尤其抗逆性強的生物體內的NHX基因，將對進一步深入了解它們的功能及創(chuàng)制新種質都具有重要的意義。

釀酒酵母NHX1基因編碼的Na+，K+/H+反向轉運體是酵母CPA家族的重要成員，定位于液胞膜和內膜系統(tǒng)，對維持離子動態(tài)平衡、調節(jié)pH及液胞融合起著重要的作用［36-37］。因此，建立釀酒酵母NHX1基因缺失突變菌株以用于植物或動物NHX基因的鑒定及功能研究具有重要意義。本研究利用側翼同源PCR構建含有KanMX選擇標記基因及與釀酒酵母NHX1基因序列上下游同源的基因敲除組件，通過同源重組的方式成功敲除酵母NHX1基因，構建了具有G418抗性的BJ3505NHX1基因缺陷型突變株，并通過互補試驗對酵母NHX1基因的功能及突變菌株進行了驗證。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質粒 釀酒酵母BJ3505（Saccharomyces cerevisiaeBJ3505）、 大 腸 桿 菌（Escherichia coli）DH5α、質粒 pFA6a-kanMX6、pDR196。

1.1.2 主要試劑與儀器 Taq DNA Polymerase（Fermentas）用于突變株鑒定；高保真PrimeSTARTMHS DNA Polymerase（TaKaRa）用于基因克隆和敲除組建克隆；DNA分子標準marker、質粒提取試劑盒、膠回收試劑盒、酵母DNA提取試劑盒均購自天根試劑公司產品；G418和FM4-64購自索萊寶公司；PCR儀和電泳儀設備為Bio-Rad；搖床、培養(yǎng)箱購自上海一恒；激光共聚焦顯微鏡（Olympus）。

1.1.3 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件 大腸桿菌培養(yǎng)基為LB（1.0%胰化蛋白胨，1.0%氯化鈉，0.5%酵母提取物，pH 7.0，固體培養(yǎng)基需加入1.5%的瓊脂）培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)。BJ3505酵母菌基突變株培養(yǎng)基為YPD（1.0%酵母提取物，2.0%蛋白胨，2.0%葡萄糖，固體培養(yǎng)基需加入2.0%瓊脂）和YPD+G418培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)。互補菌株篩選及生長培養(yǎng)基為SCURA+G418選擇培養(yǎng)基。部分酵母生長實驗在AP（10 mmol/L精氨酸，8.0 mmol/L磷酸，2.0 mmol/L硫酸鎂，1.0 mmol/L氯化鉀，0.2 mmol/L氯化鈣，2.0%的葡萄糖，微量元素及維生素）培養(yǎng)基上進行。

1.1.4 引物 本研究所用各引物序列見表1，根據(jù)質粒和基因已知序列利用Primer5.0軟件設計，由華大基因公司合成。

1.2 nhx1突變菌株及互補菌株的構建

1.2.1 BJ3505Δnhx1突變株的構建及篩選驗證 以質粒pFA6a-kanMX6為模板，用Ko-F和Ko-R引物擴增獲得敲除組件［38-39］。PCR反應條件：98℃5 min ；98℃ 10 s、69℃ 15 s、72℃ 100 s，30 個循環(huán) ；72℃ 10 min。PCR產物經核酸電泳，膠回收純化。回收獲得的目的產物利用醋酸鋰法轉入感受態(tài)細胞BJ3505，利用G418抗性篩選陽性菌落，獲得單菌落進一步在含有200 μg/mL G418的YPD培養(yǎng)板上篩選。對獲得具有抗性的菌株進行擴增培養(yǎng)并提取DNA，利用酵母NHX1基因上游引物NHX-F與NHX1基因序列內引物NHX-R或KanMX序列內引物KanMX-R進一步鑒定驗證。

1.2.2 互補菌株（BJ3505Δnhx1-C）的構建及篩選驗證 為了確定BJ3505Δnhx1的缺陷表型是由NHX1基因缺失引起的，本實驗構建了功能互補菌株，以驗證其表型能否恢復。提取BJ3505基因組DNA作為模板，用帶有酶切位點的引物ScNHX1-Sal1-F和ScNHX1-Xho1-R進行PCR擴增，得到NHX1基因的開放閱讀框，經酶切膠回收后與相同內切酶雙酶切的pDR196載體酶連，構建得到轉化載體pDR196-NHX1，經測序正確后利用醋酸鋰法轉入BJ3505Δnhx1突變株中，在含有G418的SC-URA選擇培養(yǎng)板上篩選，獲得的陽性菌株擴增培養(yǎng)并提取酵母總DNA，以此為模板，利用引物pDR96-F和pDR96-R進行PCR擴增驗證。同時，空載質粒pDR196作為對照也轉入BJ3505Δnhx1突變株中并篩選獲得陽性菌株。

表1 引物序列

1.2.3 BJ3505Δnhx1和互補菌株的抗逆能力測定 為了研究抗逆耐受，將用于實驗的菌株先在相應的篩選板上劃線培養(yǎng)。挑取單菌落接到AP培養(yǎng)基中震蕩過夜培養(yǎng)，5 000×g離心后用無菌去離子水懸浮，再次離心，重復漂洗3次。用酶標儀測定菌液OD600值，調整起始濃度為0.12，10倍梯度稀釋后取樣4 μL點在含有NaCl、LiCl或潮霉素的YPD板或含有KCl的AP板上，培養(yǎng)板倒置于30℃培養(yǎng)箱內培養(yǎng)3 d，根據(jù)菌落生長情況鑒定抗逆能力。

1.2.4 BJ3505Δnhx1和互補菌株的液胞形態(tài)觀察 試驗菌株在篩選板上劃板培養(yǎng)，挑取單菌落接種到液體篩選培養(yǎng)基內震蕩過夜培養(yǎng)，取100 μL菌液加入到含有10 mmol/L FM4-64的YPD培養(yǎng)液中，置于搖床內30℃過夜培養(yǎng)。取1.0 mL菌液放于離心管內，4℃ 4 000 r/min離心2 min，用PBS漂洗，再次離心，重復3次后用150 μL PBS懸浮菌體，取懸浮菌液20 μL，已熔冷卻至50℃的0.6%瓊脂糖溶液20 μL，加入同一離心管內混勻，取15 μL滴于載玻片中央，蓋好蓋玻片，于熒光顯微鏡下觀察液胞形態(tài)。

2 結果

2.1 突變菌株構建結果

2.1.1 敲除組件擴增結果 以質粒pFA6a-kanMX6為模板，擴增大小為1 560 bp的敲除組件片段，核酸電泳結果（圖1）顯示得到與預期大小相符的單一片段條帶；膠回收測序鑒定與預期序列信息完全符合。

圖 1 PCR擴增敲除組件

2.1.2 突變菌株鑒定 利用醋酸鋰法將純化的敲除組件導入釀酒酵母BJ3505，通過同源重組敲除酵母NHX1基因，經PCR鑒定轉化結果。突變菌株可以用引物NHX1-F和KanMX-R擴增出1 220 bp的條帶，而引物NHX1-F和NHX1-R不能擴增出條帶。野生型酵母可以用引物NHX1-F和NHX1-R擴增出817 bp的條帶，而用引物NHX1-F和KanMX-R不能擴出條帶。由于引物NHX1-R和KanMX-R分別是位于酵母基因NHX1和敲除組件內的序列，與酵母NHX1基因上游的引物NHX1-F組合，擴增結果說明同源重組整合成功，得到NHX1基因敲除突變菌株（圖 2）。

圖 2 NHX1突變體驗證

2.2 互補菌株構建結構篩選結果

以BJ3505總基因組DNA為模板，擴增包含酶切位點及保護堿基在內的NHX1基因完整的開放閱讀框1 920 bp（圖3），經酶切后與相同雙酶切的載體pDR196酶連構建互補載體pDR196-NHX1。將測序正確的pDR196-NHX1利用醋酸鋰轉化法導入酵母突變株BJ3505Δnhx1內，經含有G418的SC-URA篩選培養(yǎng)基篩選，利用引物pDR96-F和pDR96-R進行PCR鑒定。構建成功的互補菌株中可以擴增出2 353 bp的片段，而未導入互補載體的突變菌株擴增不出條帶，證明互補菌株構建成功（圖4）。為進一步確定互補載體轉入成功，我們提取酵母中的質粒，進行測序驗證，結果表明酵母中存在的質粒為轉入成功的互補質粒。

圖 3 NHX1基因克隆

2.3 BJ3505Δnhx1和互補菌株的抗逆能力測定結果

圖 4 互補菌株PCR鑒定

為了檢測酵母ScNHX1的離子轉運特性及突變菌株對逆境脅迫的響應能力，我們進行了脅迫條件下的酵母平板生長實驗。酵母生長實驗分別在含有潮霉素B、氯化鈉或氯化鋰的YPD培養(yǎng)基上或含有高濃度氯化鉀的AP培養(yǎng)基上進行（圖5）。酵母突變體 BJ3505Δnhx1在含有 800 mmol/L KCl、150 mmol/L NaCl或12 mmol/L LiCl的培養(yǎng)基上生長受到嚴重抑制，而在同等條件下野生型酵母BJ3505可以正常生長（圖5-A-C）。酵母NHX1可以恢復突變株BJ3505Δnhx1對高鉀、高鹽或高鋰的耐受能力，表達了ScNHX1的互補菌株的生長與野生型菌株生長相近，而轉入空載pDR196質粒的突變菌株未恢復其耐受性。BJ3505Δnhx1酵母突變菌對潮霉素B（50 μg/mL）敏感，但互補菌株表現(xiàn)出與野生型接近的潮霉素B耐受性（圖5-D），這暗示ScNHX1可能參與膜微囊運輸過程。這些結果表明，ScNHX1在酵母內調節(jié)K+、Na+及Li+的動態(tài)平衡，酵母NHX1基因的缺失導致突變株BJ3505Δnhx1抗逆能力降低，也從另一方面證明酵母突變株構建成功。

2.4 BJ3505Δnhx1和互補菌株液胞形態(tài)

熒光染料FM4-64染色的酵母在熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，酵母突變體BJ3505Δnhx1液胞形態(tài)異常，表現(xiàn)為一個酵母內存在多個液胞，而野生型及互補菌株表現(xiàn)為單液胞，同時發(fā)現(xiàn)在轉入空載體的突變菌株中液胞也未恢復到野生型酵母水平（圖6）。這些現(xiàn)象說明，利用此法使酵母NHX1基因缺失導致液胞融合過程發(fā)生了改變，引起了液胞結構異常。

3 討論

圖 5 BJ3505Δnhx1和BJ3505Δnhx1-C抗逆性結果

圖 6 BJ3505Δnhx1和BJ3505Δnhx1-C液胞形態(tài)

酵母利用同源重組敲除基因的方法簡單易行，可以在不影響基因組內其它功能基因的情況下對目的基因精準敲除。虞蘭蘭等［40］利用部分缺失的外源leu2片段取代了酵母染色體上的正常LEU2基因，構建了克魯式乳酸酵母leu2突變體。Rothstein等［41］對一步中斷法敲除基因的方法進行了研究，證明了該方法的可行性。Gaxiola等［42］利用篩選標記基因對酵母多個基因進行了同源重組敲除，通過功能互補對植物中相似基因進行了研究。Qiu等［43-44］也通過對酵母NHX1基因的敲除構建了nhx1突變株，發(fā)現(xiàn)酵母NHX1調節(jié)酵母液胞融合的起始過程。本文所用一步基因中斷法具有突變位點明確，突變機制清楚，突變效率高及穩(wěn)定性高等特點，通過已知選擇基因KanMX序列與染色體上目的基因的同源重組與取代，成功敲除了NHX1基因，構建了穩(wěn)定的釀酒酵母BJ3505的突變體（圖1，圖2），并成功克隆NHX1基因，得到互補菌株BJ3505Δnhx1-C（圖3，圖4），進一步通過互補試驗對酵母NHX1基因的功能進行了驗證（圖5，圖6）。構建獲得的釀酒酵母BJ3505Δnhx1突變體將為新克隆的NHX基因的功能驗證提供便利。

在植物中一般認為質膜NHXs負責向胞外排出Na+，液胞膜NHXs將Na+區(qū)域化到液胞中，而內膜NHXs在內膜系統(tǒng)內的Na+運輸具有重要作用，且大部分NHXs具有K+轉運功能。同時，在擬南芥內研究表明，不同的AtNHXs對離子的偏好性具有差異，AtNHX1偏好K+，AtSOS1/NHX7偏好 Na+，AtNHX8偏好 Li+，而 AtNHX5 和 AtNHX6 偏好 Na+和 K+［45］。雖然在酵母體內還有ENA、NHA、KHA等離子轉運體的存在，但是NHX1基因的缺失，使NHX1蛋白不能在酵母體內合成，相應的功能缺失，導致突變菌株對逆境脅迫敏感，降低抗逆能力，液胞形態(tài)異常（圖5，圖6），本實驗得到與相關報道相一致的結果［43，46-48］，說明釀酒酵母NHX1反向轉運體在酵母體內具有不可替代的作用。實驗結果還表明，釀酒酵母NHX1基因的缺失導致對Na+、K+和Li+的耐受性都降低，而互補NHX1可以恢復耐受能力，說明NHX1具有對這些離子的轉運能力，這也預示酵母NHX1可能同時具有擬南芥各成員NHXs的偏好轉運活性。

有研究表明，擬南芥內膜NHXs在囊泡運輸和融合過程具有重要作用，酵母NHX1調節(jié)液胞融合的起始過程，說明二者在液胞融合中具有相似的功能。我們的實驗結果也證明，敲除酵母NHX1基因導致液胞形態(tài)異常，出現(xiàn)多液胞現(xiàn)象，這再次證明酵母缺失NHX1會導致導致蛋白相應功能喪失，液胞融合活力降低（圖6）。釀酒酵母NHX1是具有12個跨膜區(qū)的離子反向轉運體，其轉運功能對調節(jié)液胞、細胞質及內膜系統(tǒng)內離子和pH的動態(tài)平衡具有決定性的作用，這也就會導致其缺失致使酵母表現(xiàn)出明顯的特征，如抗逆性降低、液胞形態(tài)異常等。因此，利用酵母已知功能的NHX1的缺失突變體可以檢測高等生物某一未知功能蛋白是否具有相似的功能，或對一些已知NHX進行互補試驗也具有重要意義。擬南芥AtNHX1、AtSOS1的功能就在酵母nhx1突變體內得到了證實及驗證。

4 結論

本研究利用同源重組法成功的構建了NHX1基因缺失突變株，并通過實驗證明釀酒酵母NHX1作為重要的離子反向轉運體，在釀酒酵母BJ3505抵抗外界脅迫環(huán)境和液胞融合過程中發(fā)揮著重要的作用，同時，通過互補試驗對酵母突變體構建的可行性進行了驗證。