TLR-9 基因多態性與膝骨關節炎的易感性研究

黃飛飛 毛應德龍

作者單位：浙江中醫藥大學附屬第二醫院檢驗科（黃飛飛）、骨科（毛應德龍）（杭州310005）

骨關節炎（OA）是一種常見的遲發性退行性關節病，目前關于OA 的病因學或骨重建與軟骨退化的相對重要性知之甚少。近年研究顯示，除年齡、性別、體質指數（BMI）、種族和創傷等因素外外，還有許多遺傳因素被確定與OA 的發病有關[1-2]。Toll 樣受體（TLRs）是一類模式識別分子，在先天免疫系統中發揮獨特的功能[3]。TLR-9 位于染色體3p21.2 上，通過其配體刺激TLR-9 觸發所有TLR 共有的信號傳導途徑，導致核因子-κB（NF-κB）轉錄因子的激活和促炎細胞因子的產生[4]。本研究通過檢測TLR9 基因rs187084 和rs5743836 位點單核苷酸多態性，探討其基因多態性與膝骨關節炎（KOA）易感性的關系，報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 2013 年4 月—2017 年5 月期間浙江中醫藥大學附屬第二醫院收治的145 例KOA 患者作為研究組，同時期招募145 名健康受試者作為對照組，膝骨關節炎的嚴重程度采用Kellgren-Lawrence 分級[5]評價，研究組排除標準：（1）其它類型的關節炎；（2）既往有膝關節外傷手術史；（3）患有代謝性骨病；（4）類風濕性關節炎患者；（5）患有糖尿病、高血壓的患者。對照組排除標準：（1）既往有膝關節外傷手術史；（2）患有免疫系統疾病的患者；（3）患有代謝性骨病的患者。本研究獲得我醫院學倫理委員會審核通過，所有受試者均簽署知情同意書。

表1 研究組和對照組一般資料比較

圖1 TLR9 基因rs187084 位點和rs5743836 位點測序結果。A-C 分別為rs187084 位點TT、TC、CC 基因型測序結果。D-F 分別為rs5743836 位點CC、CT、TT 基因型測序結果

1.2 方 法 取所有受試者靜脈血2mL，采用EDTA-K2 抗凝后采用硅膠模技術純化受試者基因組DNA，試劑盒為QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit（品牌：Qiagen，型號61104），保存于-20℃冰箱。根據NCBI 數據庫中TLR9 基因rs187084 和rs5743836 位點序列信息設計PCR 擴增引物，rs187084 位點引物序 列 為 上 游：5’-ACTGGATCCTGGGGATGCAGA-3’，下游：5’-AGCTGACATTCCAGCAGGGGA-3’。rs5743836 位點引物序列為上游：5’-CGGAAGATG TTGCAAGGCTGT-3’，下游：5’-GGGCCAGGGTGTA GCTTGAG-3’。引物由上海生工生物工程技術公司合成。

1.3 基因分型 根據設計的引物，以提取的基因組DNA 作為模板進行PCR 擴增，反應體系為20μL，其中基因組DNA 50ng，10×PCR 緩沖液2μL，1.5μL 25mmol/L 的Mg2+，1μL 10μmol/L dNTP，10pmol/L 的上下游引物各1μL，DNA 聚合酶1U，無菌水補足至20μL。PCR 翻譯條件為：95℃預變性5min，然后94℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，30 個循環后72℃延伸5min。PCR 完成后將PCR 擴增產物送上海生工生工生物工程技術公司進行測序，分析受試者TLR9 基因rs187084 和rs5743836 位點基因型，結果見圖1。

1.4 統計學方法 應用SPSS20.0 軟件，計量資料以均值±標準差（）表示，組間比較采用t 檢驗。計數資料以[例（%）]表示，組間比較采用χ2檢驗。用χ2檢驗分析基因型分布是否符合Hardy-Weinberg 平衡。使用χ2檢驗或Fisher 精確檢驗分析等位基因和基因型頻率的差異，估計比值比（OR）和95%置信區間（CI）。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 研究組與對照組基線資料比較 兩組受試者的年齡、體質指數（BMI）、性別、Kellgren-Lawrence 分級等一般資料見表1，研究組患者年齡、BMI 均顯著高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.01），性別差異無統計學意義（P＞0.05）。

2.2 TLR9 基因SNP 與膝骨關節炎風險的相關性TLR9 基因rs187084 位點和rs5743836 位點基因型頻率符合Hardy-Weinberg 平衡（P＞0.05）。rs187084位點基因型頻率在研究組和對照組間差異有統計學意義（χ2=10.42，P=0.01），CC 基因型是膝骨關節炎（KOA）的保護因素（OR=0.321，95%CI=0.147-0.690，P=0.001），C 等位基因是膝骨關節炎（KOA）發生的保護因素（OR=0.599，95%CI=0.424-0.847，P=0.002）。rs5743836 位點基因型頻率在研究組和對照組之間的差異無統計學意義（χ2=5.14，P=0.08），T 等位基因不是膝骨關節炎（KOA）發生的危險因素（OR=0.680，95%CI=0.417-1.108，P=0.102），見表2。

2.3 TLR9 基因SNP 與性別之間的相關性 比較不同性別之間TLR9 基因rs187084 位點和rs5743836位點基因型頻率之間的差異結果顯示，TLR9 基因rs187084 位點和rs5743836 位點基因型頻率在男性和女性之間的差異無統計學意義（P＞0.05），見表3。

表2 研究組和對照組TLR9 基因SNP 與KOA 風險的相關性位點基因型和等位基因頻率[例（%）]

表3 TLR9 基因SNP 與性別之間的相關性[例（%）]

2.4 TLR9 基因SNP 與年齡之間的相關性 以55歲為界限，比較不同年齡下TLR9 基因rs187084 位點和rs5743836 位點基因型頻率之間的差異，結果顯示，不同年齡受試者的TLR9 基因rs187084 位點基因型頻率之間差異有統計學意義（P＜0.001），TT 基因型頻率在55 歲以上年齡段受試者中較高，而CC 基因型頻率在55 歲以下受試者中較高。rs5743836 位點基因型頻率在不同年齡受試者之間的差異無統計學意義（P＞0.05），見表4。

2.5 TLR9 基因SNP 與KOA 嚴重程度的相關性分析TLR9 基因rs187084 位點和rs5743836 位點基因型頻率與Kellgren-Lawrence 分級之間的相關性，結果顯示，TLR9 基因rs187084 位點基因型頻率與Kellgren-Lawrence 分級相關，CC 基因型頻率在3 級和4 級KOA 患者中較低（OR=0.14，95%CI=0.040-0.473，P＜0.001），TC 基因型與Kellgren-Lawrence 分級無相關性（P＞0.05）。rs5743836 位點各基因型頻率與Kellgren-Lawrence 分級無相關性（P＞0.05），見表5。

表4 TLR9 基因SNP 與年齡之間的相關性[例（%）]

表5 TLR9 基因SNP 與Kellgren-Lawrence 分級相關性[例（%）]

3 討 論

TLR 有兩個非常重要的功能，首先，TLRs 通過識別微探針相關的分子模式與先天性和適應性抗感染宿主防御的激活有關；其次，TLR 在自身炎癥和炎性因子產生中起重要作用[6]。TLR9 可以識別非甲基化的富含CpG 和病原體來源的DNA 序列[7]，并通過刺激B 細胞增加自身免疫性疾病的風險[8]。

TLR9 基因的rs187084 多態性位于啟動子區域，Haploview 篩選發現它是一個標記SNP。因此，TLR9基因rs187084 多態性與相關疾病之間的關聯已被廣泛研究，如系統性紅斑狼瘡（SLE）[9]、骨關節炎[10]、瘧疾[11]和膿毒癥[12]。研究表明，在SLE 患者中發現TLR9過表達[13]，這可能刺激B 細胞并誘導SLE 發病。近年研究顯示，TLR9 可能在OA 的病因學中發揮著重要的功能，TLR9 通過夠激活NF-κB 轉錄因子來影響促炎細胞因子的產生，從而促進OA 的發展[14]。另外，有研究證實，TLR9 基因SNP 影響基因表達和功能[15]。

TLRs 是與先天和獲得性免疫反應有關的基本分子[16]。許多研究關注TLR9 啟動子多態性（rs187084）與自身免疫性疾病（如SLE）之間的關聯[9]，類風濕性關節炎[17]和OA[18]。此外，有研究顯示，TLR9 基因rs5743836 位點單核苷酸多態性與非霍奇金淋巴瘤（NHL）發生相關，rs5743836 位點突變的患者的單核細胞中TLR9 的轉錄活性增加[19]。本研究的目的是分析TLR9 基因的rs187084 位點和rs5743836 位點單核苷酸多態性與KOA 易感性的關系，結果顯示，研究組患者中攜帶rs187084 位點突變型等位基因C的頻率顯著低于對照組，說明rs187084 位點C 等位基因是KOA 的保護因素，與Balbaloglu 等[18]研究結果一致。另外，Suet 等[20]研究了中國臺灣人群TLR9基因rs187084 位點多態性與膝骨關節炎的風險之間的相關性，結果顯示，rs187084 多態性的T 等位基因與OA 的風險增加有關，同樣與本研究結果一致。本研究并未發現rs5743836 位點多態性與KOA 易感性之間的相關性，而在Carvalho 等[21]研究中發現TLR9基因rs5743836 多態性與TLR9 介導的疾病發生相關，攜帶TC 基因型rs5743836 的單核細胞中，IL-6上調TLR9 表達，導致對CpG 的細胞響應加劇，包括IL-6 產生和B 細胞增殖。本研究并未觀察到這種相關性，筆者分析認為可能與樣本量過小有關。

年齡和性別等因素也與KOA 的發生相關[22]，本研究同時還分析了TLR-9 基因的rs187084 位點和rs5743836 位點單核苷酸多態性與年齡、性別相關性，結果顯示，TLR9 基因rs187084 位點和rs5743836位點基因型頻率在男性和女性之間差異無統計學意義（P>0.05），說明這兩個位點與性別無相關性，而在不同年齡受試者中rs187084 位點基因型頻率有顯著差異，具體表現為在高年齡受試者中TT 基因型頻率較高，結合老年患者KOA 風險高我們可以發現，TT基因型受試者是KOA 危險因素。此外，本研究還發現，TLR9 基因rs187084 位點基因型頻率與Kellgren-Lawrence 分級相關，CC 基因型頻率在Kellgren-Lawrence 分級3 級和4 級中較低，說明KOA 越嚴重，CC 基因型頻率越低，由此可見C 等位基因是KOA 的保護因素。

本研究有以下不足之處。首先，吸煙、飲酒等生活習慣因素可能會對結果產生影響。其次，樣本量相對較小，統計分析的功效較差。第三，在這項基于醫院的病例對照研究中，選擇偏倚是不可避免的。最后，由于有限的臨床信息，未進一步的亞組分析。

綜上所述，TLR9 基因rs187084 1486 T>C 位點單核苷酸多態性與KOA 易感性相關，rs5743836 1237 C>T 位點單核苷酸多態性與KOA 易感性不相關。還需要進一步擴大樣本量進行驗證。