堆肥土壤中黃曲霉毒素降解菌株的篩選及活性分析

王佳偉， 宋根娣*， 楊瑞先， 韓 露， 趙振華

（1.洛陽理工學(xué)院環(huán)境工程與化學(xué)學(xué)院，河南洛陽 471023；2.河南省畜牧總站，河南鄭州 450008）

黃曲霉毒素（AFT）是由黃曲霉或寄生曲霉等真菌在生長后期產(chǎn)生的次生代謝物，能夠在收割前后、運(yùn)輸、貯存等多個(gè)環(huán)節(jié)污染如花生、玉米等農(nóng)產(chǎn)品，造成經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重制約農(nóng)業(yè)、畜牧業(yè)等領(lǐng)域的發(fā)展（Rocha等，2014）。目前已經(jīng)鑒定出的黃曲霉毒素及其衍生物約有20種，其中黃曲霉毒素B1（AFB1）因其具有高致突變、肝毒性、致畸性及免疫抑制等作用，成為糧食作物和動(dòng)物飼料最主要的污染物之一（Anthony等，2012；Dors等，2011）。

黃曲霉毒素耐高溫，穩(wěn)定性強(qiáng)，主要的防治策略集中在物理吸附和化學(xué)消解等方面，如熱處理、蒙脫石吸附、膨化、抗氧化劑處理等（Mishra等，2003；Bailey等，1994）。 這些方法均造成不同程度的營養(yǎng)物質(zhì)流失，甚至引入新的有害物質(zhì)（Zhao等，2011）。生物防治主要通過細(xì)菌或真菌等微生物及其代謝產(chǎn)物降解霉菌毒素，與理化方法相比，具有處理?xiàng)l件溫和，營養(yǎng)物質(zhì)損失小、專一性強(qiáng)等特點(diǎn)，在黃曲霉毒素的去除方面具有廣泛的應(yīng)用前景 （Samuel等，2014；Alberts等，2006）。目前，已經(jīng)報(bào)道具有降解黃曲霉毒素的細(xì)菌主要有紅色棒狀桿菌、黃桿菌、分支桿菌、短波單胞菌屬、紅平紅球菌、橙色黏球菌、枯草芽孢桿菌和巨大芽孢桿菌等 （Adebo等，2016；Sangare等，2014）。同時(shí)，許多真菌，如假密環(huán)菌、糙皮側(cè)耳等也被發(fā)現(xiàn)能夠降解黃曲霉毒素 （Yehia等，2014；Alberts等，2009）。 但是真菌的培養(yǎng)時(shí)間較長，代謝產(chǎn)物復(fù)雜，在一定條件下可能產(chǎn)生毒素等特點(diǎn)，制約了其在霉菌毒素降解領(lǐng)域的應(yīng)用（Eshelli等，2015）。相比之下，細(xì)菌更具有大規(guī)模生產(chǎn)的潛力，特別是如芽孢桿菌等毒素降解益生菌的開發(fā)，在黃曲霉毒素降解方面具有較強(qiáng)的適用性（Adebo 等，2016）。

因此，本研究以動(dòng)物糞便以及糞便堆肥土壤為材料，分離篩選能夠有效降解AFB1的細(xì)菌，并對(duì)其毒素降解活性進(jìn)行分析，初步確定了活性物質(zhì)的性質(zhì)，為進(jìn)一步研究其降解機(jī)制及在生產(chǎn)中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集和培養(yǎng)基 樣品主要為豬牛糞便以及糞便堆肥覆蓋土壤（距離表土2～5 cm處）。

菌體擴(kuò)增用LB培養(yǎng)基：酵母膏5 g，胰蛋白胨 10 g，NaCl 10 g，蒸餾水 1000 mL，pH 7.2 ～7.4，固體培養(yǎng)基另加18 g瓊脂粉。

初篩培養(yǎng)基：KH2PO40.2 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，KNO30.4 g，（NH4）2SO40.5 g，CaCl2·2H2O 0.005 g，F(xiàn)eCl3·6H2O 0.005 g，pH 7.0， 蒸餾水 1000 mL，瓊脂18 g，121°C高壓蒸汽滅菌20 min后，加入過濾除菌的香豆素溶液至終濃度為0.1%。

發(fā)酵培養(yǎng)基：牛肉膏5 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，葡萄糖 1 g，加水至 1000 mL，pH 7.0 ～ 7.2，121 °C高壓滅菌20 min。

1.2 AFB1降解菌株的分離與篩選 初篩：分別取5 g樣品加入95 mL無菌生理鹽水稀釋混勻，37°C孵育2 h，按照5%接種量接種于LB培養(yǎng)基，170 r/min、37°C振蕩培養(yǎng)20 h。取5%菌液接種于初篩液體培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)5次，進(jìn)行初篩菌的富集和馴化。在LB平板上進(jìn)行劃線、培養(yǎng)、挑取單菌落，保存?zhèn)溆谩?/p>

復(fù)篩：將初篩菌株分別接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，160 r/min、37°C發(fā)酵培養(yǎng)3 d。取950μL菌體發(fā)酵液與50μL 10μg/mL AFB1標(biāo)準(zhǔn)品置于1.5 mL滅菌離心管中，AFB1標(biāo)品終濃度為0.5μg/mL，設(shè)置相同比例的無菌發(fā)酵培養(yǎng)基加AFB1標(biāo)品為空白對(duì)照，37°C避光孵育3 d。

1.3 AFB1的提取與檢測(cè) 將孵育3 d后的樣品12000 r/min離心5 min，取上清，10%甲醇水溶液稀釋，用ELISA檢測(cè)試劑盒（美國Beacon）進(jìn)行AFB1含量的檢測(cè)，具體步驟參見試劑盒說明書。

AFB1降解率/%=（對(duì)照組AFB1含量-試驗(yàn)組AFB1含量）/對(duì)照組 AFB1含量×100。

1.4 菌株的鑒定 通過對(duì)比篩選菌株的AFB1降解率，挑選降解率最高的菌株，命名為SG16。分別通過細(xì)胞形態(tài)、生理生化檢測(cè)及16SrRNA序列分析鑒定其種屬。

細(xì)胞形態(tài)鑒定：將SG16菌株劃線培養(yǎng)在LB平板，37°C培養(yǎng)2 d，觀察菌落形態(tài)。挑取單菌落進(jìn)行革蘭氏染色。

生理生化鑒定：參考《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》第8版，進(jìn)行SG16菌株的V-P、水解淀粉、明膠液化和甲基紅等試驗(yàn)。

16SrRNA序列分析：細(xì)菌DNA提取試劑盒（天根生化科技（北京）有限公司）提取SG16基因組 DNA， 以 16S rRNA 通用引物 27F：5’-AGAGTITGATCCTGGCTCAG-3’，1492R：5’ -GGT TACCTTGTTACGACTT-3’，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增程序：94 °C 5 min；94 °C 40 s，55 °C 40 s，72 °C 1 min；72°C 10 min，35個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠（含EB）110 V電泳25 min，凝膠成像系統(tǒng)采集圖像。擴(kuò)增片段送上海生工生物工程有限公司（上海）測(cè)序。采用Clustal X 2.0軟件進(jìn)行序列對(duì)比，并通過MEGA 5.0軟件構(gòu)建Neighbour-Joining（NJ）系統(tǒng)發(fā)育樹，Bootstrap重復(fù)1000次。

1.5 SG16對(duì)AFB1的降解活性分析 發(fā)酵液各組分的降解活性：按照5%接種量將SG16接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，取5 mL菌體發(fā)酵液12000 r/min、4°C離心10 min，制備發(fā)酵上清液。菌體細(xì)胞用無菌蒸餾水洗滌3次，重懸于5 mL無菌蒸餾水，制備細(xì)胞懸液。洗滌后的菌體細(xì)胞加入5 mL無菌蒸餾水，超聲波破碎（工作條件：超聲時(shí)間4 s，間隙時(shí)間 5 s，工作次數(shù)：一輪 50 次，共 2 輪），12000 r/min、4°C離心15 min，取上清為胞內(nèi)液組分。按照復(fù)篩的方法，將SG16菌體培養(yǎng)液（全發(fā)酵液）、發(fā)酵上清液、菌懸液、胞內(nèi)液分別與AFB1標(biāo)品共孵育，以無菌蒸餾水稀釋AFB1標(biāo)品作為空白對(duì)照，分別 在 3、6、12、24、48、72 h 取 樣 檢 測(cè) 各 組 分 對(duì)AFB1的降解率，每個(gè)樣品3次重復(fù)。

濃縮發(fā)酵液的制備與降解率檢測(cè)：取100 mL SG16菌體發(fā)酵液，12000 r/min、4°C 離心 15 min，收集上清液，聚乙二醇20000透析濃縮100倍，制備濃縮發(fā)酵液，與AFB1標(biāo)品共孵育，檢測(cè)降解率。

發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵液降解活性的影響：將SG16菌株采用5%接種量，37°C發(fā)酵培養(yǎng)，從培養(yǎng)24 h開始，每間隔12 h取樣，制備濃縮發(fā)酵液，進(jìn)行AFB1降解率檢測(cè)，確定SG16菌株的最佳發(fā)酵時(shí)間。

溫度對(duì)發(fā)酵液降解活性的影響：毒素降解反應(yīng)的環(huán)境溫度選擇 20、30、37、40 °C 及 50 °C 五個(gè)梯度。將50μL AFB1加入無菌離心管，溫度達(dá)到穩(wěn)定后，再加入濃縮發(fā)酵液，避光孵育48 h，檢測(cè)毒素降解率。

pH對(duì)發(fā)酵液降解活性的影響：分別采用檸檬酸鹽-磷酸鹽溶液和Tris-HCl溶液制備pH 4～9的緩沖液。取不同pH的緩沖液與濃縮發(fā)酵液混勻，使混合發(fā)酵液的初始pH為4.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、9.0，分別取相同濃度的混合發(fā)酵液與AFB1標(biāo)品共孵育48 h后，檢測(cè)降解率。以各自pH的等濃度無菌發(fā)酵液加AFB1作為空白對(duì)照。

金屬離子、蛋白酶K對(duì)發(fā)酵液降解活性的影響：制備濃縮發(fā)酵液和AFB1的混合物，分別加入ZnSO4、MgSO4、MnSO4、FeSO4、CuSO4以 及 蛋 白 酶K，金屬離子的終濃度均為10 mol/mL，蛋白酶K的終濃度為1 mg/mL。避光孵育48 h后，以未處理濃縮發(fā)酵液為空白對(duì)照，檢測(cè)降解率。

1.6 濃縮發(fā)酵液對(duì)玉米中AFB1的降解分析 將玉米樣品粉碎過篩，取直徑1.2～1.8 mm的玉米顆粒50 g，37°C、濕度80%放置12 d制備霉變玉米。取10 mL濃縮發(fā)酵液與發(fā)霉顆?；靹颍?7°C培養(yǎng)72 h，每隔12 h混勻一次。依照GB 5009.22-2016（食品中黃曲霉毒素B族和G族的測(cè)定）分別對(duì)發(fā)霉玉米和發(fā)酵液處理72 h后的AFB1含量進(jìn)行檢測(cè)。

1.7 數(shù)據(jù)分析 試驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，結(jié)果用“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，不同組間的差異性分析采用one-way ANOVA方法，其中P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 降解菌株的篩選和鑒定 以香豆素為唯一碳源進(jìn)行富集和馴化，共獲得6株可利用香豆素的菌株，其中3株來源于動(dòng)物糞便，3株來源于糞便堆肥的土壤。進(jìn)一步復(fù)篩發(fā)現(xiàn)，這6株菌對(duì)AFB1均表現(xiàn)不同程度的降解活性，其中活性最低的為土壤源的SG18，降解率為13.83%，降解活性最高的為土壤源的SG16，降解率為85.50%。因此，進(jìn)一步的研究選擇SG16作為目標(biāo)菌株。

菌株SG16在LB培養(yǎng)基上菌落大而凸起，表面粗糙呈白色，革蘭氏染色呈陽性，桿狀，兩端鈍圓（圖1）。生理生化檢測(cè)結(jié)果顯示，SG16菌株能分解葡萄糖、淀粉、明膠等大分子物質(zhì)，符合芽孢桿菌能夠利用蛋白質(zhì)、多糖和淀粉的特性，結(jié)合菌落觀察，參照《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》（8版）初步判斷SG16菌株屬于芽孢桿菌屬。

圖1 SG16菌株的形態(tài)學(xué)觀察

利用SG16基因組DNA為模板擴(kuò)增16S rRNA片段，條帶回收，測(cè)序后片段大小1472 bp，利用同源序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2）。結(jié)果顯示，SG16菌株與解淀粉芽孢桿菌BFE5300（登錄號(hào)：GU250445.1）同源性最高為99%。因此，綜合形態(tài)特征、生理生化結(jié)果以及系統(tǒng)發(fā)育樹，可以初步確定SG16為解淀粉芽孢桿菌。

圖2 根據(jù)16S rRNA序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹

2.2 SG16發(fā)酵組分對(duì)AFB1的降解作用 對(duì)比SG16菌體培養(yǎng)液、菌懸液、胞內(nèi)液以及發(fā)酵上清對(duì)AFB1的降解率，如圖3所示，菌體培養(yǎng)液是全發(fā)酵液，毒素降解活性最高，為85.50%。發(fā)酵上清也具有較高的降解活性，作用24 h降解率達(dá)到64.89%，最大降解率為80.62%，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)值與菌體發(fā)酵液效果均差異不顯著（P＞0.05），且最高的降解率均出現(xiàn)在48 h。而菌懸液和胞內(nèi)液的降解活性相對(duì)較低，其中胞內(nèi)液最高為10.67%，菌懸液為14.32%，且菌懸液和胞內(nèi)液各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的檢測(cè)值均差異不顯著 （P＞0.05）。因此，SG16降解AFB1的活性物質(zhì)主要存在于發(fā)酵上清，屬于細(xì)胞外物質(zhì)。

圖3 SG16菌株培養(yǎng)液、菌懸液、胞內(nèi)液及發(fā)酵上清對(duì)AFB1的降解率

2.3 不同發(fā)酵時(shí)間SG16的毒素降解率 由圖4所示，發(fā)酵時(shí)間24 h，降解率最低為24.36%，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，濃縮發(fā)酵液的AFB1降解率呈上升趨勢(shì)，發(fā)酵時(shí)間60 h，降解率為88.74%，繼續(xù)延長發(fā)酵時(shí)間，降解率有所上升（培養(yǎng)72 h，降解率91.23%），但差異不顯著（P＞0.05）。本研究中SG16的發(fā)酵體系，均采用5%接種量，發(fā)酵過程中產(chǎn)物濃度主要與發(fā)酵時(shí)間相關(guān)，且降解率與發(fā)酵時(shí)間呈現(xiàn)正相關(guān)。另外，發(fā)酵60 h的降解率與72 h降解率差異不顯著，因此SG16菌株的最適發(fā)酵周期為60 h。

圖4 不同發(fā)酵時(shí)間SG16的毒素降解率

2.4 不同環(huán)境溫度條件下SG16發(fā)酵液的毒素降解率 溫度條件能夠影響SG16菌株的毒素降解活性 （圖5），濃縮發(fā)酵液的毒素降解率在37°C時(shí)最高為90.56%，35、40°C降解率均有所降低，但差異不顯著，表明SG16的毒素降解活性物質(zhì)在35～40°C，均能表現(xiàn)較高的活性。升高和降低溫度，降解率均出現(xiàn)顯著降低（P＜0.05）。溫度為20°C降解率降為43.35%；50°C降解率為52.68%。

圖5 不同溫度條件下SG16的毒素降解率

2.5 不同pH條件下SG16發(fā)酵液的毒素降解率利用緩沖液制備不同pH的反應(yīng)液，通過加入相同濃度的濃縮發(fā)酵液，進(jìn)行毒素降解活性的測(cè)定（圖6）。結(jié)果顯示，pH值能夠影響SG16的毒素降解活性。pH約為7.5時(shí)，降解率最高為89.64%，且隨著pH上升和下降，降解率均出現(xiàn)降低的趨勢(shì)。

圖6 不同pH條件下SG16的毒素降解率

2.6 金屬離子及蛋白酶K對(duì)SG16菌株降解AFB1的影響 本研究選用的金屬離子對(duì)SG16的毒素降解活性均表現(xiàn)抑制作用，其中Gu2+抑制最強(qiáng)，濃縮發(fā)酵液降解率為43.40%，Mg2+的抑制作用最弱，處理后降解率為73.66%，顯著低于對(duì)照（90.21%），其他金屬離子的抑制作用均無顯著差異（P＞0.05）（圖7）。蛋白酶K處理后，濃縮發(fā)酵上清的降解率為28.34%，顯著高于金屬離子的抑制作用。因此，結(jié)合溫度、pH對(duì)SG16毒素降解率的影響，本研究獲得的SG16菌株發(fā)酵上清中降解AFB1活性物質(zhì)推測(cè)是一種（類）胞外酶，降解反應(yīng)可能是一類酶促反應(yīng)。

圖7 金屬離子及蛋白酶K對(duì)SG16毒素降解率的影響

2.7 濃縮發(fā)酵液對(duì)玉米中AFB1的降解率 霉變的玉米顆粒經(jīng)SG16濃縮發(fā)酵液處理，AFB1含量由69.5μg/kg降低為13.2μg/kg，低于國家玉米作物中AFB1的限量，降低率達(dá)到81.0%。

3 討論

黃曲霉毒素主要通過污染糧食作物，進(jìn)而危害畜禽和人類健康。因此，針對(duì)黃曲霉毒素降解菌的篩選，除了降解效率之外，菌種的安全性和應(yīng)用性也是重要的篩選標(biāo)準(zhǔn)。土壤中含有豐富的微生物資源，特別是毒素污染物富集的土壤，成為篩選毒素降解菌的主要來源（李超波等，2012）。本研究以動(dòng)物糞便以及糞便堆肥土壤為材料，共篩選出6株具有AFB1降解潛力的菌株，其中3株來源于動(dòng)物糞便，3株來源于糞便堆肥的土壤，研究表明堆肥土壤來源的菌株SG16對(duì)AFB1降解活性最強(qiáng)為85.50%，并初步確定為解淀粉芽孢桿菌。

解淀粉芽孢桿菌屬于革蘭氏陽性菌，與枯草芽孢桿菌親緣關(guān)系較高，具有好氧、環(huán)境友好、對(duì)畜禽及人類無毒等特點(diǎn)，在生長過程中能夠產(chǎn)生一系列顯著抑制病原真菌和細(xì)菌生長的代謝產(chǎn)物（張娟等，2014）。特別是從動(dòng)物糞便及腸道內(nèi)容物中分離的芽孢桿菌作為新型的益生菌添加劑具有廣泛的應(yīng)用前景。本研究篩選的SG16菌株來源于豬牛糞便堆肥的土壤，且被確定為一株解淀粉芽孢桿菌，進(jìn)一步的結(jié)果顯示，SG16全發(fā)酵液、菌懸液、胞內(nèi)液以及發(fā)酵上清對(duì)AFB1的降解率不同，發(fā)酵上清液最高為80.62%，與全發(fā)酵液差異不顯著，菌懸液和胞內(nèi)液的降解活性較低，證明SG16的降解活性物質(zhì)主要存在于發(fā)酵上清，屬于胞外物質(zhì)。這與孫玲玉等（2014）從泰山土壤中分離的有效降解AFB1的泰山枯草芽孢桿菌的結(jié)果一致。另外，對(duì)SG16發(fā)酵上清液的熱穩(wěn)定性和pH耐受性的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，濃縮發(fā)酵液在pH為7.5，毒素降解率最高為89.64%，且隨著pH上升和下降，降解率均出現(xiàn)降低的趨勢(shì)。溫度為37°C時(shí)降解率最高為90.56%，35、40°C降解率均有所降低，但差異不顯著，升高和降低溫度，降解率均出現(xiàn)顯著降低（P＜0.05）。因此，本研究篩選獲得的SG16菌株AFB1降解活性物質(zhì)的最適pH為7.5，且在35～40°C時(shí)，均能表現(xiàn)較高的降解活性，證明SG16發(fā)酵液具有較高的實(shí)際應(yīng)用潛力。

本研究中SG16濃縮發(fā)酵液經(jīng)金屬離子和蛋白酶K處理后，毒素降解率降低，且蛋白酶K處理組降解率為28.34%，顯著低于對(duì)照，表明SG16產(chǎn)生的毒素降解物質(zhì)可能是一種或一類胞外酶。Guan 等（2008）的研究發(fā)現(xiàn)，Cu2+和 Zn2+能夠顯著抑制AFB1毒素降解酶蛋白的活性，而Mg2+能夠激活酶的活性。李超波等（2012）從金毛羚牛糞便中分離的一株假單胞菌屬菌株，其AFB1降解物質(zhì)被證明為胞內(nèi)酶，同樣Cu2+能夠顯著抑制酶蛋白活性，Mg2+能夠增強(qiáng)酶活。而本研究中，濃縮發(fā)酵液在不同金屬離子處理后，毒素降解活性均被抑制，Mg2+的抑制作用最弱，毒素降解率為73.66%，但也顯著低于對(duì)照（降解率90.21%），其原因可能是菌種的差異，以及降解酶的來源不同導(dǎo)致的。

為了提高SG16的應(yīng)用價(jià)值，本研究采用濃縮發(fā)酵液直接處理霉變的玉米顆粒，AFB1降低率達(dá)到81.0%，含量由69.5μg/kg降低為13.2μg/kg，低于國家標(biāo)準(zhǔn)中玉米作物AFB1的限量。通過簡單的發(fā)酵和濃縮，SG16能夠表現(xiàn)出顯著的毒素降解活性，這為實(shí)際生產(chǎn)的應(yīng)用提供依據(jù)。

4 結(jié)論

本研究從動(dòng)物糞便堆肥土壤中分離到一株能高效降解AFB1的細(xì)菌SG16，其濃縮發(fā)酵液對(duì)AFB1標(biāo)準(zhǔn)物的降解率達(dá)到90%以上，初步確定為解淀粉芽孢桿菌。SG16菌株產(chǎn)生的毒素降解活性物質(zhì)主要在發(fā)酵上清液，可能是一種胞外酶，且能有效降解玉米中的AFB1。