解淀粉芽孢桿菌HN固體菌劑發酵制備技術研究

張峰峰，周 可，謝鳳行，趙 瓊，趙玉潔

（天津市農業生物技術研究中心，天津 300192）

解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）及其代謝產物具有豐富的生物學活性和廣泛的抗致病菌功能，對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、鮑曼不動桿菌（Boottanun 等，2017）、黃曲霉（Wang等，2015）等均具有較強的抑制作用，在種植業中不僅可以促進植物生長，還可防治黃瓜枯萎病（Shao等，2015）、葡萄霜霉病（Guo 等，2017）等，在養殖業不僅可以作為飼料添加劑提高養殖生物生產性能（Ahmed等，2014），還可抑制消化道內有害微生物，改善動物腸道健康（Selim等，2015），改善免疫功能，提高抗病能力（Reda 等，2015），另外，該菌株還可凈化養殖環境，防治水體富營養化，抑制藍藻水華（Yu 等，2015；李超等，2011），具有廣闊的應用前景。

本實驗室從天津市西青區污染河溝污泥分離鑒定了一株解淀粉芽孢桿菌HN（Bacillus amyloliquefaciens HN），研究發現其在不同污染水體中對硝酸鹽氮、亞硝酸鹽氮以及化學需氧量（COD）等均有很好的去除效果 （Xie等，2013；謝鳳行等，2012），環境耐受能力強，在較寬的溫度、pH及鹽濃度的范圍內都能正常生長（謝鳳行等，2013），且其產胞外淀粉酶和蛋白酶能力均較強（謝鳳行等，2010、2009）。

為了中試生產需要對該菌株進行液體發酵培養基和培養條件的優化，液體發酵活菌濃度最高可達41.7×108cfu/mL（謝鳳行等，2013）。然而液體發酵技術，對設備要求高，生產工藝復雜，成本高，菌數低，易污染；而固體發酵采用的原料一般是廉價的農副產品（如豆粕、麩皮等），產用的設備也較液體發酵簡單，無需處理大量污水，發酵產品經烘干粉碎不需其他加工處理即可得到固體菌劑，生產成本大大低于液體發酵（杜英，2013），且固體發酵產品菌數、芽孢數（王卉等，2016；楊柳等，2013）和部分代謝產物含量（Prajapati等，2015；Zhu 等，2013）均高于液體發酵產品，使用效果更好，且固體發酵產品干燥后更易于長距離運輸，有利于菌劑更大范圍的推廣和應用。為此，本研究對解淀粉芽孢桿菌HN固體發酵培養基配方和發酵條件進行試驗，以提高固體發酵產物活菌數，為生產上進行規模固體發酵高濃度菌劑提供技術支撐。

1 材料和方法

1.1 材料 供試菌種解淀粉芽孢桿菌HN（B.amyloliquefaciens HN）分離自天津市西青區某污染河溝污泥，由中國農業微生物菌種保藏管理中心進行鑒定，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號CGMCC No.3261。

1.2 試驗方法 種子液制備：種子液的制備將30℃恒溫培養箱中培養24 h的斜面菌株接一環放入種子培養液中，置于30℃、150r/min下振蕩培養24h，制成含菌量為1.0×109cfu/mL的種子液。液體培養基成分為可溶性淀粉10g，蛋白胨10g，NaCl 3g，K2HPO41g，MgSO4·7H2O0.5g，CaCO31g，水1000mL。

固體發酵方法：每1000 mL直筒塑料瓶中裝100 g固體物料（以麩皮計）培養基，用封口膜封口，121℃滅菌20 min，冷卻至室溫，接入種子液，混勻后于25～30℃恒溫培養箱中靜置培養，間時拍打，使其均勻生長，培養48 h。稱取10 g固體發酵物，90 mL無菌水稀釋后，150 r/min下振蕩30 min，涂板進行菌落計數，重復3次。各因素在前一因素的最佳水平下逐級優化。

1.3 試驗設計

1.3.1 培養基物料對固體發酵的影響 選取價格低廉的工農業廢棄物麩皮、玉米粉、豆粕、大豆粉等制備基質，對菌株進行固體發酵，121℃滅菌30 min，冷卻后接入HN種子液，30℃ 培養48 h。涂板計數。

1.3.2 外加碳源、氮源、無機鹽對固體發酵的影響 為研究外加碳源對固體發酵的影響分別向固態基質中添加0.2%的可溶性淀粉、乳糖、麥芽糖、葡萄糖和蔗糖；為研究外加氮源對固體發酵的影響分別向固態基質中添加0.2%的蛋白胨、胰蛋白胨和酵母浸粉；為研究外加無機鹽對固體發酵的影響分別向固態基質中添加0.02%的NaH2PO4·2H2O，KH2PO4、MnSO4·H2O、MgSO4·7H2O 和 FeSO4·7H2O，發酵條件按照30℃培養48 h，菌落計數，重復3次。將不添加任何外加物質作為空白對照，根據外源物質的單因素篩選結果，選擇對固體發酵水平影響較大的可溶性淀粉、 蛋白胨、KH2PO4、MgSO4·7H2O設計4因素3水平正交試驗。

1.3.3 料水質量比對固體發酵的影響 料水優化試驗調節培養基料水（水量包括接種的20 mL菌液） 質量比為 1∶2、1∶1.5、1∶1.2、1∶1、1∶0.8、1∶0.6、1∶0.4、1∶0.2。

1.3.4 接種量對固體發酵的影響 接種量優化試驗按照5%、10%、15%、20%和25%的接種量接種HN菌懸液；攪拌均勻，30℃培養48 h，菌落計數，重復3次。

1.3.5 溫度對固體發酵的影響 溫度優化試驗將發酵溫度設置為 20、25、28、33、37 ℃， 培養 48 h，菌落計數，重復3次。

1.3.6 最佳培養條件下的生長曲線 時間優化試驗分別將固體發酵物培養 0、6、12、18、24、30、36、42、48 h和 54 h，菌落計數，重復 3次。

1.3.7 干燥方法對菌劑菌數的影響 使用不同的干燥溫度和干燥方法，測定固體菌劑含水量和活菌濃度變化。

1.3.8 固體菌劑的激活試驗 加入無菌水對菌劑進行二次發酵，測定活菌濃度。

1.4 數據分析 試驗結果用“平均數±標準差”表示，運用軟件SPSS 19.0，經 One-way ANOVA分析，采用Duncan’s多重檢驗分析試驗結果的差異顯著性，P＜0.05為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 不同培養基物料對HN固體發酵菌數的影響在固體發酵過程中，固體底物具有雙重功能，一方面底物可為微生物生長繁殖提供營養物質，另一方面是提供微生物的黏附的功能。固體底物的資源存量、價格和保存時間等是影響其選擇為固體發酵底物的關鍵因素，本試驗對HN菌數影響結果見圖1。隨著發酵物料的不同，各個處理固體發酵的菌數不同，其中以麩皮為底物的處理菌數最高，為 2.94×1010cfu/g，顯著高于其他處理（P ＜ 0.05）。可能是麩皮物料比較膨松，在HN的生長過程中可提供適宜的好氧環境，同時可能該菌能夠較容易地破碎麩皮，并利用麩皮中的營養物質進行繁殖，在以后的試驗中選取麩皮作為固體發酵底物。

2.2 外源添加物質對HN固體發酵菌數的影響

圖1 不同固體物料對HN固體發酵菌數的影響

2.2.1 碳氮源對HN固體發酵菌數的影響 碳源或氮源對菌數的影響見圖2。結果表明淀粉、乳糖、蔗糖等碳源的添加處理和對照未添加碳氮源相比，固體發酵菌數有顯著的提高（P＜0.05），而添加葡萄糖處理的菌數和對照無顯著差異（P＞0.05），而添加麥芽糖處理的菌數顯著低于對照（P＜0.05）。考慮到添加碳源物質的成本、溶解性和保存的特點，試驗最終選擇淀粉作為發酵培養基的碳源。選擇的三種氮源添加處理和對照相比，添加蛋白胨和胰蛋白胨的處理菌數顯著高于對照（P＜0.05），而酵母浸粉和對照相比，無顯著差異（P＞0.05），而蛋白胨具有購買方便、價格較低、容易保存等特點，因此選擇其作為發酵培養基的基本氮源。

圖2 不同碳氮源添加對HN固體發酵菌數的影響

2.2.2 無機鹽對HN固體發酵菌數的影響 無機鹽對菌數的影響見圖3。與對照相比，添加KH2PO4、MgSO4·7H2O的處理菌數顯著增加 （P＜0.05），說明這兩種無機鹽對菌體生長具有較好的促進作用，而添加 FeSO4·7H2O、NaH2PO4·2H2O兩種無機鹽處理的菌數和對照相比無顯著差異（P ＞ 0.05），而添加 MnSO4·H2O 處理的菌數顯著低于對照，說明MnSO4對菌體的生長有顯著的抑制作用。因此，在HN固體發酵過程中選擇KH2PO4、MgSO4·7H2O 作為緩沖物和金屬鹽用于固體發酵。

圖3 不同無機鹽對HN固體發酵菌數的影響

2.2.3 外源物質對HN固體發酵影響的正交試驗 由極差分析（表1）可知，影響HN固體發酵的主次因素為可溶性淀粉＞蛋白胨＞KH2PO4＞Mg-SO4·7H2O。最佳水平組合為A2B2C3D3。因此，固體發酵最優外源物質組成為可溶性淀粉、蛋白胨、KH2PO4和MgSO4·7H2O，添加量分別為固體物料的0.2%、0.2%、0.1%、0.03%。由表2可知，可溶性淀粉對菌數的影響達到顯著水平 （P＜0.05），在固體發酵過程中應嚴格控制可溶性淀粉的使用量，而其他因素影響未達到顯著水平（P ＞ 0.05）。

表1 固體發酵培養基外源物質組分正交試驗結果

2.3 不同料水比對HN固體發酵菌數的影響本試驗結果表明（圖4），隨著水分含量逐漸減小，菌數出現先升高后降低的趨勢，在料水比為1∶0.8的條件下，菌數最高，為3×1010cfu/g，顯著高于其他處理（P＜0.05），說明培養基中的水分含量對固

表2 固體發酵培養基外源物質組分正交試驗結果方差分析

體發酵菌數的影響特別明顯，而料水比1∶0.8的處理下，菌株的通氣和營養物質的轉化達到最佳平衡，既可使固態基質保持疏松，充分利用氧氣的流通和熱量的傳遞；又可為微生物生長提供營養，繁殖產生大量菌體。因此，試驗選擇料水比1∶0.8的處理進行固體發酵。

圖4 不同料水比對HN固體發酵菌數的影響

2.4 不同接種量對HN固體發酵菌數的影響由圖5可知，本試驗中HN菌落數隨接種量的增加呈先升高后降低的趨勢，接種量為20%時，HN菌落數達到最大值。

圖5 不同接種量對HN固體發酵菌數的影響

2.5 不同培養溫度對HN固體發酵菌數的影響由圖6可知，該菌株在20～37℃均能生長。當溫度為28℃時，固體發酵菌數最多，為3.69×1010cfu/g，顯著高于其他溫度發酵物含菌量 （P＜ 0.05），說明28℃為該菌最適宜的固體發酵溫度。

圖6 不同溫度對HN固體發酵菌數的影響

2.6 HN在最優條件下的生長曲線 在最優培養基和最優條件下，菌株HN在18 h進入對數生長期，在 48 h 達到最大值 3.99×1010cfu/g（圖 7）。菌株HN主要通過菌體細胞繁殖消耗水體中的有害物質從而達到凈化水質的目的，因此，HN的固體發酵周期控制在48 h內較為合理。

圖7 HN固體發酵生長曲線

2.7 不同干燥方法對固體菌劑含水量及活菌數的影響 由于芽孢桿菌具有較好的耐熱性能，所以，選擇50℃和60℃烘干以及室溫風干三種干燥方式，測定不同干燥方式下菌劑含水量和菌濃度的變化。從表3可以看出，采用不同干燥方式，固體菌劑的含水量變化不同，其中在50℃和60℃烘干的條件下，菌劑含水量在24 h內均降低至8%以下，而風干方式下固體菌劑含水量60 h后降低至9%以下。說明在烘干條件下干燥菌劑較自然風干條件下干燥菌劑的效率較高，可提高1倍以上。不同方式的干燥過程中菌數均有顯著的降低趨勢，到最終干燥結束（即含水量低于9%），測定在50℃和60℃烘干的條件下，活菌濃度分別為 24.35×108cfu/g 和 30.24×108cfu/g，而在自然風干條件下，活菌濃度為49.67×108cfu/g，均顯著低于初始濃度3.8×1010cfu/g。說明干燥過程中由于水分的蒸發使活菌數減少較多，且烘干處理的活菌數顯著低于自然風干處理的活菌數 （P＜0.05）。對不同干燥方式測定的含水量和菌數進行相關性分析發現，各個處理的含水量和菌數的相關性均達到極顯著相關（P＜0.01），說明菌劑的活菌數受菌劑中含水量影響較大，在以后的菌劑生產和使用中要重點考慮水分對菌數的影響。對比三種干燥方法，如果考慮生產效率，則采用烘干的方法，要考慮菌數含量，則采取自然風干的方法。

表3 干燥方式對HN固體發酵物含水量和活菌數的影響

2.8 固體菌劑的激活試驗 由于干燥后活菌數顯著降低，后期使用過程中如何提高活菌數成為需要解決的問題。取干燥后的菌劑，按照1∶0.8的料水比例，加入無菌水，28℃培養，進行激活發酵，定時進行活菌數測定發現（圖8），菌劑的活菌數逐漸增加，在發酵48 h后，菌劑的活菌數達到3.72×1010cfu/g，和固體發酵菌劑干燥前水平相當，在以后的實際應用中，可以指導用戶加入干凈水進行二次發酵激活菌劑，從而提高菌劑的菌數，增強使用效果。

圖8 干燥后菌劑的激活試驗

3 討論

在固體發酵過程中，固體發酵基質是主要的影響因素。王卉等（2016）則采用花生餅粉∶麩皮∶棉籽粕=53∶35∶12（m∶m∶m）作為基質進行解淀粉芽孢桿菌的固體發酵，最終活菌數最高為2.13×1010cfu/g；楊柳等（2013）研究結果也表明麩皮和豆粕為芽孢桿菌最適發酵基質，該發酵基質被分解后不易結塊，孔隙率和通氣性較好，有利于菌株的生長繁殖。秦宇軒等（2017）選擇麩皮和豆粕的碳氮比為1∶2.8基礎上添加20%的稻谷殼，稻谷殼堅硬的外殼能夠對固態基質起到有效的支撐作用，以此來增加固態基質中空氣的流動性，從而促進解淀粉芽孢桿菌的生長，菌數達1.68×1010cfu/g。本研究通過比較不同發酵基質發現麩皮為最佳的發酵基質，菌數可達 2.94×1010cfu/g。

固體發酵物中的碳源和氮源是影響微生物生長繁殖和產生次級代謝產物的另一個重要因素。一般常用的外加碳源有葡萄糖、淀粉、蔗糖、麥芽糖和甘油等。外加氮源主要有蛋白胨、豆粉、硫酸銨、硝酸銨和酵母浸粉等。碳氮源質量比也非常重要，若碳源過多，菌株可能生長緩慢，易被雜菌污染而失效；氮源過多，微生物就會大量繁殖，不利于次級代謝產物的累積。本試驗最終采用可溶性淀粉作為外加碳源，蛋白胨作為外加氮源，最適濃度均為0.2%。無機離子在固體發酵過程中也起到重要作用，其能夠調節固體發酵基質的酸堿平衡、維持滲透壓、構成如蛋白質等活性物質的輔基或功能團等，本試驗結果表明，KH2PO4、MgSO4·7H2O能夠顯著增加菌落總數，有研究證明MgSO4·7H2O可促進芽孢桿菌生長繁殖，增加酶類等物質的分泌活性（Vimala 等，2015）。

料水質量比主要通過影響固體發酵過程中的供氧量和孔隙度來決定固體發酵的水平，是決定固體發酵能否成功的重要因素（梁雪杰等，2013）。高料水質量比時固態培養基水分含量過少，會影響溶氧能力和傳遞氧能力，從而限制菌落的生長；低料水質量比可使固態培養基凝結成塊，導致多孔性、溶氧量和散熱性降低而影響發酵水平，增加雜菌污染的機率和干燥成本。本試驗料水質量比最終采用1∶0.8，一方面可使固態基質保持疏松，充分利用氧氣的流通和熱量的傳遞；另一方面可為微生物生長提供營養。

固體發酵通常采用菌懸液作為種子培養基，以液固2相的發酵方式進行，需要合適的接種量。本試驗經過優化選取20%的接種量，因為接種量較小會延長發酵周期，成本增大，且會增加雜菌污染機率，影響發酵產品質量（梁雪杰等，2013）；接種量過大會加速固體發酵培養基的消耗，使基質中溶氧不足或營養物質過度消耗，不利于菌落數的增加，且菌株產生的次級代謝物會抑制菌落的繁殖，降低菌株固體發酵的數量（孫鎮平等，2014）。

固體發酵的培養溫度是影響菌體生長的重要環境條件，在液體發酵培養條件優化過程中發現HN的最適生長溫度為37℃（謝鳳行等，2013）。本試驗結果表明，HN的最適發酵溫度為28℃，究其原因，可能是固體發酵過程中散熱較液體發酵慢，菌體自身發酵產生熱量可促進菌體的生長，如果固體發酵環境溫度過高，則會影響菌體的生長。

固體發酵的時間一般是3～7 d，發酵時間對微生物繁殖有著重要的影響。發酵周期短，基質營養利用不充分，造成浪費；周期過長，菌體自溶，影響活力，本試驗發現HN固體發酵48 h菌數達到最高值，而后再繼續發酵導致固體培養基中氨化嚴重，物料變黑，氣味刺鼻，嚴重影響了菌劑的品質。

本研究通過優化解淀粉芽孢桿菌HN的固體培養基和培養條件，確定了最佳固體培養基質為麩皮；外源物最優添加量（百分比按固態基質質量為基準）為可溶性淀粉0.2%，蛋白胨0.2%，KH2PO40.1%，MgSO4·7H2O 0.03%，溫度 28 ℃，料水比為1∶0.8，進行 48 h的發酵，解淀粉芽孢桿菌的菌數可達3.99×1010cfu/g以上。

固體發酵后菌劑的干燥過程也是菌劑生產中最重要的環節，發酵產品菌數較高，干燥效果直接關系最后菌劑的使用效果。其中菌劑的水分含量是首要的測定指標，過高則達不到產品要求，菌劑易發生霉變，過低則導致菌劑活菌數過低，影響使用效果。參考NYT 2131-2012《飼料添加劑 枯草芽孢桿菌》菌劑標準，水分含量達到9%以下方為合格菌劑，因此，本研究采用三種干燥方法對菌劑的水分進行去除，在測定含水量使其達到標準的同時測定菌劑中的活菌數，結果表明，隨著含水量的減少，菌劑活菌數也相應減少。最終在含水量達到9%以下時活菌數減少80%以上。其中，自然風干處理的活菌數顯著高于烘干兩個處理的活菌數，但烘干處理對水分的蒸發效率顯著高于自然風干處理。在以后的規模生產中，要考慮生產效率和活菌含量平衡的同時，降低成本，尋找出一個更可靠的干燥方法。

二次發酵激活是很多固體菌劑使用過程中遇到的問題，由于芽孢桿菌芽孢的休眠特性，在菌劑使用前，進行適當的激活發酵，可以提高活菌數，降低芽孢休眠對使用效果的影響，從本研究中二次發酵效果表明，激活對菌劑活菌數的提升具有顯著的效果，在以后的實際應用中應適當的推廣應用。

本研究均為實驗室內控制條件下進行的小規模發酵試驗，和生產中的規模發酵效果可能會有所差異（Zhu等，2014），因此本研究僅為大規模生產的固體發酵條件提供了基礎參考，還需進一步的進行規模驗證。