巴爾喀什黑傘3種胞外纖維素酶活力變化規律研究

黃春霖 林辰壹 劉玉 李薩

摘 要：巴爾喀什黑傘是新疆獨有的珍稀野生食藥用真菌，為了解其對纖維素的降解特性，試驗以羧甲基纖維素為培養基內的固定碳源，測定巴爾喀什黑傘在液體培養條件下菌絲體生長過程中羧甲基纖維素酶、濾紙酶、β-葡萄糖苷酶活力，探討其胞外纖維素酶活力變化規律。結果顯示，巴爾喀什黑傘純菌絲體培養過程中，羧甲基纖維素酶活力峰值出現在第3 天，為0.406 U·mL-1，濾紙酶活力峰值出現在第2天，為0.238 U·mL-1，二者變化規律均表現出峰值后波動降低的趨勢;β-葡萄糖苷酶活力變化近“S”型，峰值出現在第12天，為1.233 U·mL-1，該酶活力峰值出現時間較濾紙酶和羧甲基纖維素酶明顯滯后。

關鍵詞：巴爾喀什黑傘;碳源;羧甲基纖維素;纖維素酶

中圖分類號：TQ920.1 文獻標識碼：A DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2018.11.015

Study on the Change Regularity of Extracellular Enzyme Activity of Agaricus balchaschensis

HUANG Chunlin1， LIN Chenyi1， LIU Yu2， LI Sa1

（1. College of Forestry and Horticulture， Xinjiang Agricultural University， Urumqi，Xinjiang 830052， China; 2. Agricultural Technology Promotion Center in Midong District in Urumqi， Urumqi， Xinjiang 831400， China ）

Abstract： The Agaricusbalchaschensis is a unique and rare wild edible medicinal fungus in Xinjiang. In order to understand its degradation to cellulose， carboxymethyl cellulose（CMC） was used as a fixed carbon source in the culture medium to determine the activities of carboxymethyl cellulase， filter paper enzymes（FP） and β-glucosidase（BG） of A. balchaschensis. The results showed that during the cultivation of the pure mycelium of A. balchaschensis， the peak of CMC activity appeared on the third day， which was 0.406 U·mL-1， and the peak of enzyme activity of FP appeared on the second day， which was 0.238 U·mL-1， both of the two enzymatic activity above showed a tendency to decrease after the peak. The BG activity had a tendency nearly "S" type， and the peak appeared on the 12th day， which was 1.233 U·mL-1， the peak appearance time was significantly delayed compared to FP and CMC activity.

Key words： Agaricus balchaschensis;carbon source;carboxymethyl cellulose;cellulase

新疆地大物博，享有得天獨厚的自然環境優勢，隨著農業產業化結構的調整升級，加之新疆獨有的野生食用菌資源豐富，對于新疆農業可持續性發展以及食用菌的生產存在著諸多的發展潛力和機遇。巴爾喀什黑傘（Agaricus balchaschensis Samgina & G.A.Nam）隸屬于蘑菇科蘑菇屬[1]，是國內獨有的且僅分布于新疆博斯騰湖和巴里坤湖等內陸湖泊沿岸，極具營養價值的珍稀野生食用菌[2]。巴爾喀什黑傘菌柄與菌蓋中富含鈣、鎂、鐵等礦質元素，含量均顯著高于雙孢蘑菇、香菇、金針菇及平菇，并且子實體中還包含12種脂肪酸，其中，亞油酸和棕櫚酸含量所占比例較大[3]，是集食藥用價值于一身的天然保健食品。

與食用菌生長密切相關的胞外酶共有6種，研究比較成熟的有纖維素酶、半纖維素酶、木質素分解酶、果膠酶、蛋白酶和淀粉酶[4]。研究認為，大多數食用菌在生長過程中對培養基內營養物質的利用與胞外酶活力變化規律是相關的，例如雙孢蘑菇在菌絲體生長時期，胞外淀粉酶活力與木質素的降解速率呈現正相關性，在子實體生長時期羧甲基纖維素酶（endo-1，4-β-D-glucanase， 簡稱CMC酶）和濾紙酶（Filter paper cellulose， 簡稱FP酶）與纖維素降解的速率呈現正相關性，子實體生物量與羧甲基纖維素酶活力高低存在正相關性[5-6]。同樣，在姬松茸的相關研究指出，姬松茸胞外CMC酶、FP酶呈周期性變化，活力高峰對應子實體成熟期[7]。纖維素酶屬于水解纖維系，其主要成分內切葡聚糖酶（CMC酶）、外切葡聚糖酶（exo-1，4-β-D-glucanase， 簡稱CBH）和β-葡萄糖苷酶（β-1，4- glucosidase， 簡稱BG酶）協同作用，經過3個水解步驟將纖維素轉化葡萄糖，并且這3個水解過程同時發生[8]。

本試驗通過研究巴爾喀什黑傘在純菌絲體培養條件下其胞外纖維素酶活力變化規律，進一步分析纖維素大分子營養物質的降解利用特性，旨在為提高巴爾喀什黑傘生物學效率以及充分挖掘其內在利用潛力提供依據。

1 材料和方法

1.1 材 料

供試菌種采用新疆農業大學園藝實驗室經組織分離低溫保藏的巴爾喀什黑傘菌株，編號為XJAU-Ab2016。

1.2 方 法

1.2.1 發酵液制備 采用曹春蕾等[9]的方法進行。將PDA加富培養基（馬鈴薯、葡萄糖、瓊脂加富培養基）中葡萄糖替換為等量的羧甲基纖維素20 g，并去除培養基中的瓊脂制成液體培養基[10]。將制備好的液體培養基分裝至250 mL三角瓶，每瓶注入培養液150 mL，其中各處理設置3次重復。每150 mL液體培養基接種直徑為5 mm菌絲圓片3片。靜置12 h后于25 ℃恒溫，150 r·min-1搖床振蕩培養，培養周期14 d。

1.2.2 待測酶液的制備 從振蕩培養開始每天同一時間均勻取發酵培養液10 mL，采用快速定量濾紙過濾后，將混合培養液分裝至5 mL離心管，4 000 r·min-1離心10 min，獲得上清液即為待測的粗酶液[11]。

（1）CMC酶活力的測定。 參照邊銀丙[12]的方法進行。向25 mL的具塞刻度試管內加入0.52%的羧甲基纖維素溶液（pH值4.8，0.1 mol·L-1的檸檬酸緩沖液配制）1.5 mL，在50 ℃水浴條件下預熱3 min后，加入待測酶液0.5 mL混勻，50 ℃水浴保溫30 min，取出后立即加入DNS（3，5二硝基水楊酸）試劑 3.0 mL，以煮沸滅活的酶液作對照，每個處理3次重復。搖勻后迅速置入沸水中，加熱10 min，流水冷卻至室溫后加蒸餾水定容至25 mL，充分混勻測540 nm處吸光值。將不同濃度的葡萄糖溶液設置6個梯度，其中每毫升標準液中所含葡萄糖量為1 mg，分別取標準液0.1～0.6 mL用蒸餾水逐一補足至2 mL與DNS試劑反應共熱，測540 nm處的吸光值，以葡萄糖含量為橫坐標，吸光值為縱坐標繪制葡萄糖標準曲線。

（2）BG酶活力的測定。 依據孫驪珠等[13]的方法并稍作調整。向25 mL具塞刻度試管中加入0.5%的水楊苷（購自Sigma公司）溶液（pH值4.8，0.1 mol·L-1的檸檬酸緩沖液配制）1.5 mL，后續操作程序同CMC酶活力測定方法。

（3）FP酶活力的測定。 參照邊銀丙[12]的方法進行。取干燥平衡24 h后的定性濾紙，剪裁成寬度1 cm，質量為（50±0.5） mg的濾紙條，將濾紙條折疊成“M”狀，置入25 mL具塞刻度試管底部;之后緩慢加入0.1 mol·L-1的檸檬酸緩沖液（pH值4.8）1.5 mL，使濾紙完全浸沒于緩沖液中;在50 ℃水浴條件下預熱3 min后，分別加入待測酶液0.5 mL，置于50 ℃水浴中保溫60 min，其余步驟同CMC酶測定。

每分鐘內轉化1 μmol底物或轉化1 μmol相關基團所需的酶量為1個酶活力單位（U·mL-1）。

酶活力=■ ×1 000×V （1）

式中，m是根據標準曲線方程計算出OD值對應的葡萄糖含量（μg）;M為葡萄糖的摩爾質量（g·mol-1）;0.5為反應時所需的酶液體積（mL）;t為水浴反應的時間（min）;1 000為轉化子（1 mmol=1 000 μmol）;V表示所取粗酶液總體積（mL）。

1.3 數據處理

試驗所得數據采用Microsoft Excel 2010整理，使用SPSS 21.0通過One-way ANOVA及Duncan法對纖維素酶活力在不同培養時間內進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 巴爾喀什黑傘CMC酶活力變化規律

巴爾喀什黑傘在14 d的培養周期內均可檢測出CMC酶活力（圖1），CMC酶活力隨培養時間的延長表現出先降低后增加至峰值，然后逐漸降低并保持相對穩定，其峰值出現在培養周期內的第3 天，為0.406 U·mL-1，顯著高于其他培養時間（P <0.05），較14 d培養周期內CMC活力均值0.265 U·mL-1高出53.2%，是活力最小值（第14天）的1.8倍;繼峰值出現后的第4～14天，CMC酶活力均顯著低于1～3 d（P <0.05），整體呈波動下降趨勢。

2.2 巴爾喀什黑傘BG酶活力變化規律

由圖2可知，隨培養時間延長，巴爾喀什黑傘BG酶活力先升高至峰值后略有下降，整體變化規律近“S”型，其峰值出現在第12天，為1.233 U·mL-1，較培養周期內該酶活力均值0.823 7 U·mL-1高出49.69%，是最小值（第2 天）的5.0倍。BG酶活力在培養周期的第1～3天差異不顯著，在第4～9 天顯著增加（P<0.05），第10天顯著下降（P<0.05）至第8 d的活力水平。第11天和第12天差異不顯著（P>0.05），活力均顯著高于其他各培養時間（P<0.05）。第13天和第14天顯著下降（P<0.05）至第9天的活力水平。

2.3 巴爾喀什黑傘FP酶活力變化規律

由圖3可知，隨培養時間延長，巴爾喀什黑傘FP酶活力呈現先增大后波動降低的趨勢，后期保持相對平穩的水平。FP酶活力峰值出現在培養周期內的第2天，為0.238 U·mL-1，顯著高于其他培養時間（P <0.05），較培養周期內FP酶活力均值0.231 U·mL-1高出3.0%，是最小值（第8、14天）的1.7倍。培養周期的第3天和第6天 FP酶活力值顯著低于第2天（P<0.05），顯著高于第1天、第4天、第8天、第10～14天（P<0.05）。

3 結論與討論

巴爾喀什黑傘在以羧甲基纖維素為碳源的條件下，均可檢測出CMC酶、BG酶和FP酶的活力。在巴爾喀什黑傘菌絲體生長期間，CMC酶活力峰值出現后開始下降并趨于穩定。在雙孢蘑菇中，菌絲體生長時期CMC酶活力在其整個生長發育階段處于最低水平，但隨著培養時間的不斷增加，菌絲體CMC酶活力緩慢增加[14]，這與本研究的結果有所差異，說明巴爾喀什黑傘對纖維素代謝能力有其自身的特性。由于纖維素酶屬于誘導酶系[15]，不同底物所構成的培養基對CMC酶活力具有誘導作用[16]，因此，要提高巴爾喀什黑傘纖維素代謝水平以及產纖維素酶的能力，可能需在培養基質中添加相應的誘導物質。BG酶在菌絲體生長期間表現出遞增的趨勢，隨培養時間的延長持續增大并趨于穩定，變化規律呈近“S”型。BG酶活力峰值出現的時間為第12天，相對于FP酶及CMC酶活力峰值具有明顯的滯后性，這也驗證了CMC酶在降解纖維素的同時，多種胞外纖維素酶協同作用，最終由BG酶水解纖維二糖轉換為單糖，逐步積累供菌絲體利用的作用機理[17]。

FP酶在培養周期內同樣表現出達到峰值后活力下降，整體保持相對平穩的變化趨勢，這與梁志英等[18]對姬松茸的相關研究中發現菌絲體生長時期FP酶活力變化保持相對平穩的趨勢結論一致，該研究還指出姬松茸對纖維素的降解能力低于木質素，而本文對于巴爾喀什黑傘利用木質素的能力是否優于纖維素還有待進一步的探究。由于濾紙可以表現出與纖維素聚合度及結晶度一致的條件，故可用FP酶表征纖維素酶的總糖化能力[19]，通過巴爾喀什黑傘FP酶活力變化規律可知，其總糖化能力在培養周期內保持相對穩定的水平。

胞外纖維素酶的分泌對巴爾喀什黑傘營養利用具有重要的影響，同時對菌絲體生長也存在著制約或促進的作用。因此，對巴爾喀什黑傘胞外纖維素酶活力的探討能夠進一步了解其對多糖類碳源利用的特性，可為巴爾喀什黑傘資源的開發以及生理生化研究奠定基礎。

參考文獻：

[1]張金霞. 中國食用菌菌種學[M]. 北京： 中國農業出版社， 2011： 39.

[2]趙振宇. 新疆食用菌志[M]. 烏魯木齊： 新疆科技衛生出版社， 2001： 70-71.

[3]楊琴， 杜雙田， 張桂香. 博湖蘑菇礦物質、脂肪酸成分分析[J]. 食品科學， 2013， 34（6）： 231-233.

[4]顧雅君， 王瑛， 劉建榮， 等. 與食用菌相關主要酶的研究和應用[J]. 中國食用菌， 2006， 25（1）： 40-42.

[5]陳慶榆， 史鈞， 何華奇， 等. 雙孢蘑菇幾種胞外酶的活性測定[J]. 安徽科技學院學報， 2011， 25（6）： 35-38.

[6]SMITH J F， CLAYDON N， LOVE M E， et al. Effect of substrate depth on extracellular endocellulase and laccase production of Agaricus bisporus.[J]. Mycological research， 2011， 93（3）： 292-296.

[7]倪新江， 丁立孝， 潘迎捷， 等. 姬松茸在兩種培養基上生長期間九種胞外酶活性變化[J]. 菌物系統， 2001， 20（2）： 222-227.

[8]TOMME P， WARREN R A J， GILKES N R. Cellulose hydrolysis by bacteria and fungi[J]. Advances in microbial physiology， 1995， 37： 1-81.

[9]曹春蕾， 崔寶凱， 秦問敏. 桑木層孔菌液體培養過程中幾種胞外酶活性的變化[J]. 菌物學報， 2011， 30（2）： 275-280.

[10]肖興， 陳春蘭， 陳清樂， 等. 培養基和溫度對巨大口蘑菌絲生長的影響[J]. 江蘇農業科學， 2009， 37（4）：215-216.

[11]曾東方， 楊帆， 聶歡歡. DNS法對食用菌發酵液淀粉酶活力的測定[J]. 現代農業科技， 2011（11）： 16.

[12]邊銀丙. 食用菌栽培學[M]. 北京： 高等教育出版社， 2017： 298-300.

[13]孫驪珠， 羅蘭， 袁忠林. 馬纓丹提取物對黃胸散白蟻體內酶活性的影響[J]. 林業科學， 2017， 53（5）： 107-115.

[14]林新堅， 江秀紅， 林戎斌， 等. 姬松茸菌株的胞外酶活性及與產量的關系[J]. 食用菌學報， 2007， 14（3）： 28-32.

[15]高染染， 劉倩， 孫文良， 等. 粗糙脈孢菌蛋白表達系統構建研究[J]. 生物技術通報， 2016， 32（7）： 160-169.

[16]李輝， 王義強， 陳介南， 等. 里氏木霉產纖維素酶的誘導和合成機理研究進展[J]. 中國釀造， 2011， 30（6）： 8-12.

[17]張丹. 纖維素酶的研究進展及其展望[J]. 青海畜牧獸醫雜志， 2017， 47（3）： 49-52.

[18]梁志英， 孟俊龍， 劉靖宇， 等. 姬松茸碳源利用規律的研究[J]. 山西農業大學學報（自然科學版）， 2007， 27（1）： 79-81.

[19]黃慰情. 高溫纖維素降解菌的篩選、鑒定及產酶條件研究[D]. 杭州： 浙江大學， 2014.