一株鴨坦布蘇病毒的分離與鑒定

范振濤

鴨坦布蘇病毒病（ducktembusu virus disease，DTMUVD）是由鴨坦布蘇病毒（duck tembusu virus，DTMUV）感染引起的一種以產(chǎn)蛋率和采食量急劇下降為主要特征，以出血性腦膜炎、卵巢炎為主要病理變化的傳染病，該病發(fā)病率高，傳播迅速。該病主要引起蛋鴨及種鴨發(fā)病，導(dǎo)致蛋鴨采食量減少、產(chǎn)蛋率急劇降低甚至停產(chǎn)。本病除感染蛋鴨及種鴨外，還可引起多品種肉鴨發(fā)病，給中國(guó)養(yǎng)鴨業(yè)帶來巨大經(jīng)濟(jì)損失。本研究通過對(duì)發(fā)病鴨場(chǎng)鴨進(jìn)行病理剖檢、病毒分離與鑒定，成功分離到1株鴨坦布蘇病毒，進(jìn)而確定該鴨場(chǎng)的致病原為鴨坦布蘇病毒，為鴨坦布蘇病毒病的流行病學(xué)、毒株的致病性研究、疫苗與診斷試劑盒的研制提供了參考。

1材料和方法

1.1臨床癥狀與病理剖檢觀察

山東省博興縣某蛋鴨場(chǎng)，產(chǎn)蛋鴨采食量突然大幅下降，產(chǎn)蛋率急劇降低甚至停產(chǎn)。發(fā)病鴨體溫升高，排綠色稀糞，后期出現(xiàn)神經(jīng)癥狀，表現(xiàn)為癱瘓、翻滾、站立不穩(wěn)及共濟(jì)失調(diào)等。對(duì)發(fā)病鴨進(jìn)行病理解剖，可見卵巢出血、萎縮和破裂，肝臟腫大、淤血，脾臟腫大。臨床初步診斷為鴨坦布蘇病毒病，送實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行病毒分離和鑒定。

1.2病料采集與處理

無菌采集病死鴨的卵巢、脾臟、肝臟等病變組織，將組織病料與滅菌生理鹽水以1：3比例研磨成組織勻漿，-20℃反復(fù)凍融3次，12000r/min離心15min，吸取上清液備用。

1.3病毒分離

將離心后的上清液用0.45μm濾膜過濾，之后通過尿囊腔途徑接種10日齡鴨胚10枚，按照0.1mL/胚接種。同時(shí)取5枚10日齡鴨胚接種滅菌生理鹽水作為對(duì)照組。棄去24h內(nèi)死亡的鴨胚，每天照蛋觀察鴨胚的死亡情況，對(duì)死亡鴨胚剖檢，觀察病理變化，收集死亡鴨胚的尿囊液。

1.4血凝性測(cè)定

采集雞的紅細(xì)胞，制備1%雞紅細(xì)胞懸液，鑒定收集的含病毒鴨胚尿囊液有無血凝性。

1.5 RT-PCR鑒定

設(shè)計(jì)鴨坦布蘇病毒的1對(duì)特異性檢測(cè)引物，上游引物P1：5-GGCTT GTTTGGAAAAGG-3，下游引物P2：5-TTCCA GAGTACTTCACTG-3，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。利用病毒基因組提取試劑盒提取凍融后的組織病料及收獲的DTMUV鴨胚病毒液各200μL，利用一步法RT-PCR反應(yīng)試劑進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，RT-PCR反應(yīng)程序如下：50℃50min；94℃5min；94℃30s，52℃45s，72℃60s，30個(gè)循環(huán)；72℃10min，4℃終止反應(yīng)。取10μL RT-PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.6核酸序列鑒定

將RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行核酸序列測(cè)定，將測(cè)得的序列與GenBank中登錄的序列進(jìn)行比對(duì)分析。

2結(jié)果與分析

2.1病毒分離結(jié)果

接種鴨胚死亡時(shí)間均在96-120h，死亡鴨胚體表面具有出血點(diǎn)，肝臟腫大、出血嚴(yán)重，心臟出血。無菌條件下收獲死亡鴨胚的尿囊液，-20℃冷凍保存。

2.2血凝性測(cè)定結(jié)果

收集的尿囊液對(duì)1%雞紅細(xì)胞無凝集性。

2.3 RT-PCR與核酸序列鑒定結(jié)果

組織病料和鴨胚病毒液的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物均具有大小為514bp的特異性條帶，與預(yù)期大小相符。將RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的測(cè)序結(jié)果與GenBank中登記的鴨坦布蘇病毒核酸序列進(jìn)行比對(duì)，同源性高達(dá)99%以上，表明擴(kuò)增片段是鴨坦布蘇病毒的特異性序列，說明發(fā)病鴨場(chǎng)的致病原為鴨坦布蘇病毒。

3討論

鴨坦布蘇病毒屬黃病毒科黃病毒屬，該屬病毒大部分為蟲媒傳播病毒，是一種有囊膜的病毒，對(duì)乙醚和氯仿較為敏感。主要侵害鴨的生殖系統(tǒng)，導(dǎo)致種蛋鴨的采食量和產(chǎn)蛋量急劇下降。病毒進(jìn)入機(jī)體后，主要侵害血管內(nèi)皮細(xì)胞，形成病毒血癥后，脾臟、生殖器和腦組織受侵，在脾臟、卯泡膜和腦等組織中都可檢出病毒，在病鴨的咽喉和糞便中也含有病毒。該病自2010年以來開始在我國(guó)部分地區(qū)暴發(fā)和流行，對(duì)鴨坦布蘇病毒病的研究也引起了動(dòng)物防疫部門及研究學(xué)者的日益關(guān)注。病毒分離是疾病診斷最常用的方法，此外還可以采用多種實(shí)驗(yàn)室快速診斷方法，從而提高對(duì)疾病的診斷效率及準(zhǔn)確性，因此采用RT-PCR方法對(duì)本病進(jìn)行診斷，對(duì)早期臨床治療和疫情的控制顯得十分必要。本研究通過發(fā)病鴨的臨床癥狀及剖檢病理變化初步診斷為鴨坦布蘇病毒感染，通過實(shí)驗(yàn)室PCR檢測(cè)，最終確定疫情為鴨坦布蘇病毒感染，在此基礎(chǔ)上通過鴨胚分離到1株病毒，并通過PCR和序列鑒定分離毒株為鴨坦布蘇病毒。該病目前尚無有效藥物進(jìn)行治療，疫苗免疫接種對(duì)本病的防控具有重要意義，目前商品化的疫苗有WF100株弱毒疫苗和HB株滅活疫苗。除疫苗免疫外，鴨坦布蘇病毒病的防控還要加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，改善環(huán)境，建立全面的衛(wèi)生消毒制度，對(duì)鴨場(chǎng)定期消毒，消滅鴨場(chǎng)中的蚊蠅，防止蚊蠅傳播疾病，加強(qiáng)對(duì)用具設(shè)備和種蛋的消毒及病死鴨的焚燒和無害化處理，對(duì)病鴨要及時(shí)隔離、治療。本研究中鴨坦布蘇病毒的成功分離與鑒定，為發(fā)病鴨場(chǎng)找到了致病原，豐富了流行病學(xué)資料和毒株資源，為鴨坦布蘇病毒的進(jìn)一步研究及相關(guān)疫苗及診斷試劑的研制提供了研究資料。