松香含氮衍生物對小地老虎四齡幼蟲的拒食活性及構效關系

翟兆蘭， 閆鑫焱， 許 吉， 宋湛謙， 商士斌， 饒小平,3*

(1. 中國林業科學研究院 林產化學工業研究所；生物質化學利用國家工程實驗室；國家林業局 林產化學工程重點開放性實驗室；江蘇省 生物質能源與材料重點實驗室， 江蘇 南京 210042； 2. 南京林業大學 林業資源高效加工利用協同創新中心， 江蘇 南京 210037； 3. 中國林業科學研究院 林業新技術研究所， 北京 100091)

小地老虎(Agrotisypsilon)，別稱地蠶、切根蟲、地剪，屬鱗翅目夜蛾科，分布廣泛，食性雜，且食量大。3齡后的小地老虎剪苗率高，會對農作物產生重大危害[1]。目前，對小地老虎的防治方法主要是化學農藥防治，然而殺蟲劑長期大量使用，不僅會使害蟲產生抗藥性而且會引發嚴重的環境污染和農產品安全問題，從而危及人類和動物的健康[2-3]。隨著綠色環保理念的推廣，基于農業可持續發展和生態環境保護對無公害農藥的迫切需求，人們不斷探索更加安全環保的害蟲防治藥劑與方法[4-5]。昆蟲拒食劑主要通過干擾昆蟲的取食行為從而達到作物保護的目的，不會直接殺滅昆蟲，具有使用安全、對環境友好、不易產生抗藥性等優點，因而受到了廣泛的關注[5-8]。經過改性的天然資源產物中的次生物質是昆蟲拒食劑的主要來源，例如萜類、生物堿、酚類、醌類、香豆素類、糖類等不同類型的化合物[8-10]。松香是我國特有的可再生林業資源，其主要成分樹脂酸具有獨特的三環二萜結構，含有雙鍵和羧基2種官能團，易于化學修飾。以松香為原料的產品豐富，廣泛應用于國民生活的各個領域[11-13]。此外松香樹脂酸及其衍生物具有廣泛的生物活性，可用于生產具有抑菌、殺蟲、抗腫瘤及抗病毒等生物活性的產品[10, 14-17]。近年來研究發現松香衍生物具有較好的拒食活性，Klejdysz等[18]合成的松香酸離子液體對鱟蟲、赤擬谷盜蟲和谷斑皮蠹等農作物害蟲具有較強的拒食效果。本課題組前期研究發現，松香酯類及酰胺類衍生物對粘蟲、蚜蟲等農作物害蟲表現出較強的拒食活性[19-20]。本研究探索了4種不同類型的松香含氮衍生物(脫氫樅酸酰胺、脫氫樅胺(取代)苯甲醛Schiff堿、脫氫樅酸酰基硫脲和二氫樅酸酰基硫脲)對小地老虎4齡幼蟲的拒食活性，以期篩選出具有高拒食活性的松香衍生物，為今后小地老虎的防治提供安全、環保的藥劑。

1 實 驗

1.1樣品

脫氫樅酸酰胺衍生物(1a～1i)、脫氫樅胺(取代)苯甲醛Schiff堿衍生物(2a～2j)、脫氫樅酸酰基硫脲衍生物(3a～3e)和二氫樅酸酰基硫脲衍生物(4a～4h)根據文獻[21～22]的方法合成及提純，其結構式如圖1所示。所得樣品用乙醇或丙酮配成10 g/L的母液，在-20 ℃下保存備用，試驗前母液用質量分數0.1%吐溫-80的水溶液稀釋。

1.2供試靶標及培養條件

小地老虎(Agrotisypsilon)在室溫為(25±1) ℃，相對濕度為(75±5)%和光照周期光照16 h、黑暗8 h(L16∶D8,h∶h,下同)的室內繼代人工飼養。選擇個體大小一致的小地老虎4齡幼蟲供試。甘藍葉取自溫室人工栽培的甘藍，未接觸任何化學藥劑。

1.3松香含氮衍生物對小地老虎4齡幼蟲的拒食率測定

采用浸葉法進行拒食活性的測定。將新鮮甘藍葉片用清水洗凈、自然晾干，用打孔器制備直徑2.0 cm、面積314 mm2的葉碟，將其放入1.0 g/L的藥液中浸泡10 s，以質量分數0.1%吐溫-80的水溶液作參照，自然晾干，放入12孔養蟲板中，每孔放入1片葉碟，接入饑餓處理4 h且生長一致的小地老虎4齡幼蟲，每種處理重復10次。之后，將養蟲板放置于溫度為(27±1) ℃、相對濕度為(75±5)%、光照周期為L16∶D8的環境中飼養幼蟲，24 h后取出殘存的葉碟，用1 mm × 1 mm標準方格紙測量葉碟的剩余面積計算拒食率。拒食率(%) =(對照組取食面積-處理組取食面積)/對照組取食面積×100%。

1.4松香含氮衍生物對小地老虎4齡幼蟲的拒食中濃度測定

將樣品母液用質量分數0.1%吐溫-80的水溶液稀釋配制成3～4個系列濃度，按照1.3節中的方法計算不同濃度的拒食率，拒食中濃度(AFC50)的計算方法參照文獻[23]中的方法，將拒食率設為概率值y、松香含氮衍生物的濃度設成變量x，應用DPS v7.05軟件模擬得到毒力回歸方程y=ax+b，并用該方程計算拒食率為50%時的樣品濃度，即AFC50。

圖1 松香含氮衍生物的分子結構Fig. 1 The molecular structure of rosin nitrogen derivatives

2 結果與討論

2.1松香含氮衍生物對小地老虎4齡幼蟲的拒食率

松香含氮衍生物對小地老虎4齡幼蟲拒食活性的10組實驗取平均值得到取食面積，進一步計算拒食率，結果見表1。試驗中發現質量濃度為1.0 g/L的松香含氮衍生物對小地老虎4齡幼蟲無致死作用。由表1可以看出脫氫樅酸酰胺衍生物及脫氫樅酸酰基硫脲衍生物對小地老虎4齡幼蟲的拒食率均低于23%，對小地老虎4齡幼蟲無明顯拒食作用。脫氫樅胺對氯水楊醛Schiff堿(2i)處理過的甘藍葉小地老虎的取食面積大大減少，在質量濃度1.0 g/L時的拒食率為86.12%，較大地抑制了小地老虎4齡幼蟲的取食；脫氫樅胺對甲氧基苯甲醛Schiff堿(2b)對小地老虎4齡幼蟲的拒食率為52.04%，具有較強的拒食活性；其他脫氫樅胺(取代)苯甲醛Schiff堿衍生物的拒食率低于22%，未表現出對小地老虎4齡幼蟲的拒食活性；并且2a、2d和2j對小地老虎4齡幼蟲的取食表現出促進作用。二氫樅酸異丙醇酰基硫脲(4b)的拒食率為85.13%，較大地抑制了小地老虎4齡幼蟲的取食；二氫樅酸2-羥甲基-1,3-丙二醇酰基硫脲(4c)和二氫樅酸呋喃酰基硫脲(4g)的拒食率分別為66.70%和50.48%，表現出對小地老虎4齡幼蟲較強的拒食作用，其他二氫樅酸酰基硫脲衍生物對小地老虎4齡幼蟲的取食無明顯抑制作用，拒食率均小于22%。

表1 松香含氮衍生物對小地老虎4齡幼蟲的取食面積及拒食率

2.2松香含氮衍生物對小地老虎4齡幼蟲的拒食中濃度

由2.1節的結果可知脫氫樅胺(取代)苯甲醛Schiff堿衍生物2b和2i，二氫樅酸酰基硫脲衍生物4b、4c和4g對小地老虎4齡幼蟲表現出較強的拒食作用，因此繼續測定了上述5種松香含氮衍生物在不同質量濃度下對小地老虎4齡幼蟲的取食面積和拒食率，結果列于表2。并由不同質量濃度下的拒食率，應用毒力回歸方程計算拒食率為50%時的樣品質量濃度，即拒食中濃度(AFC50)，相關結果列于表3。

表2 不同質量濃度的松香含氮衍生物(2b、 2i、 4b、 4c和4g)對小地老虎4齡幼蟲的取食面積及拒食率

表3 松香含氮衍生物(2b、 2i、 4b、 4c和4g)對小地老虎的拒食中質量濃度(AFC50)

由表2可得，5種松香含氮衍生物對小地老虎4齡幼蟲的拒食活性隨濃度的降低而降低。脫氫樅胺(取代)苯甲醛Schiff堿衍生物2i在質量濃度0.001 g/L時的拒食率為14.98%，仍具有一定的拒食活性，并且2i的AFC50值極低為0.04 g/L，其值遠小于脫氫樅胺(取代)苯甲醛Schiff堿衍生物2b的AFC50(0.66 g/L)。二氫樅酸酰基硫脲衍生物4b同樣具有較低的拒食中濃度，為0.25 g/L；4c和4g的拒食中濃度分別為1.47和0.69 g/L。二氫樅酸酰基硫脲衍生物對小地老虎4齡幼蟲的拒食活性順序為4b>4g>4c。對照物梣酮對小地老虎2齡幼蟲24 h的拒食率為42.8%，拒食中質量濃度為13.40 g/L[24]，松香含氮衍生物2i、2b、4b、4g和4c的拒食中濃度均低于梣酮對小地老虎的拒食中濃度，說明松香含氮衍生物2i、2b、4b、4g和4c對小地老虎均具有較好的拒食活性。

2.3松香含氮衍生物的結構與其拒食活性的構效關系

對比4類松香含氮衍生物對小地老虎4齡幼蟲的拒食活性，脫氫樅胺(取代)苯甲醛Schiff堿和二氫樅酸酰基硫脲對小地老虎4齡幼蟲的拒食活性較高，脫氫樅酸酰胺和脫氫樅酸酰基硫脲對小地老虎4齡幼蟲的拒食活性較弱。

對比10種不同的脫氫樅胺(取代)苯甲醛Schiff堿對小地老虎4齡幼蟲的拒食活性，化合物2b遠大于2a，由圖1中的結構式可以看出，化合物2b與2a相比僅多一個甲氧基，說明甲氧基的引入大大提高了脫氫樅胺(取代)苯甲醛Schiff堿對小地老虎4齡幼蟲的拒食活性；2c和2g的拒食活性也大于2a，并且2c和2g的拒食活性相近，表明氯原子和羥基的引入增強了脫氫樅胺(取代)苯甲醛Schiff堿對小地老虎4齡幼蟲的拒食活性，并且氯原子和羥基的效果相近，將氯原子和羥基同時引入到脫氫樅胺(取代)苯甲醛Schiff堿中得到2i，大大增強了對小地老虎的拒食活性，質量濃度1 g/L時，2i對小地老虎4齡幼蟲的拒食率為86.12%。2d、2e和2f的拒食活性與2a相近，說明雖然氟原子與氯原子同為鹵素原子，但氟原子對脫氫樅胺(取代)苯甲醛Schiff堿對小地老虎4齡幼蟲的拒食活性無明顯影響。甲氧基、氯原子和羥基對脫氫樅胺(取代)苯甲醛Schiff堿對小地老虎4齡幼蟲的拒食活性具有明顯的增強作用，氯原子和羥基的同時引入更能大大提高其拒食活性。由8種二氫樅酸酰基硫脲衍生物對小地老虎4齡幼蟲拒食活性可以看出，4b和4c的拒食活性遠大于4a，即羥基位置和個數的改變對二氫樅酸酰基硫脲衍生物對小地老虎4齡幼蟲的拒食活性有明顯的影響。4h的拒食活性大于4d，表明氟原子比甲基更能增強二氫樅酸酰基硫脲衍生物對小地老虎4齡幼蟲的拒食活性。4g遠大于4e和4f，說明含有呋喃環的二氫樅酸酰基硫脲衍生物的拒食活性比含有嗎啉環和哌嗪環的好。

3 結 論

3.1研究了4種不同類型的松香含氮衍生物對小地老虎4齡幼蟲的拒食活性，篩選出5種具有較高拒食活性的松香含氮衍生物。其中2i和4b幾乎能完全抑制小地老虎4齡幼蟲的取食，質量濃度1 g/L時2i和4b24 h后的拒食率分別為86.12%和85.13%；2b、4c和4g的拒食率大于50%，對小地老虎4齡幼蟲同樣具有較強的拒食活性。2i具有極低的拒食中質量濃度 (AFC50)為0.04 g/L，2b、4b、4c和4g的AFC50分別為0.66、 0.25、 1.47和0.69 g/L。

3.2脫氫樅酸酰胺衍生物和脫氫樅酸酰基硫脲衍生物對小地老虎的拒食活性較弱且其結構變化對小地老虎4齡幼蟲的拒食活性的影響較小。脫氫樅胺(取代)苯甲醛Schiff堿衍生物和二氫樅酸酰基硫脲衍生物對小地老虎4齡幼蟲的拒食活性較高，研究發現甲氧基、氯原子和羥基對脫氫樅胺(取代)苯甲醛Schiff堿的拒食活性有明顯的增強作用；二氫樅酸酰基硫脲衍生物中羥基的位置和個數對小地老虎4齡幼蟲的拒食活性有明顯的影響。