淫羊藿苷通過VEGF通路對缺氧誘導的脈絡膜視網膜內皮細胞系RF/6A增殖、侵襲和遷移能力的調節作用①

刁婷婷 田 騁 王洪亮 姜玉珍

(南陽醫專第一附屬醫院，南陽 473000)

隨著未來人口老齡化的增加，眼病發病率及治療費用也將不斷增加[1]。過去幾十年的數據顯示白內障、青光眼、視網膜黃斑變性及增生性糖尿病視網膜病變等是主要的致盲性眼病[2]。研究表明脈絡膜視網膜血管新生是這些眼病致盲的主要原因，神經組織的高氧需求與局部缺氧之間的失衡會引起一系列血管相關生長因子的釋放，從而刺激內皮細胞的增殖和分化，進而誘導血管新生[3]。目前已存在一些治療眼病的方法，但眼病仍然是一個巨大的健康問題，給患者和社會帶來嚴重的負擔。開發新的有效的眼病治療方法對公共衛生健康系統具有重要意義。淫羊藿是一種重要的藥用植物，在數千年的時間里被用于各種傳統的中國配方以及現代中國傳統的中藥產品中。淫羊藿苷(化學結構式見圖1)是一種典型的黃酮糖苷，被認為是天然草藥淫羊霍的主要活性成分[4]。淫羊藿苷具有多種藥理學活性，如骨保護、神經保護、心血管保護、抗癌及抗炎等作用[5,6]。本文主要目的是探索淫羊藿苷對缺氧誘導脈絡膜視網膜內皮細胞系RF/6A增生和運動能力的調節作用及其機制。

圖1 淫羊藿苷化學結構式Fig.1 Chemical structural formula of Icariin

1 材料與方法

1.1細胞系及主要試劑 恒河猴視網膜血管內皮細胞RF/6A來源于美國典型培養物保藏中心(American Type Culture Collection,ATCC)。淫羊藿苷購自Sigma公司。MTT購自上海生工。Transwell小室及人工基底膜購自美國BD公司?？寡軆绕どL因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF),抗p-PI3K、抗 p-AKT和抗Rac抗體購自英國Abcam公司。

1.2方法

1.2.1藥物處理 恒河猴視網膜血管內皮細胞RF/6A分四組：正常組(Normal)：常氧處理RF/6A；對照加藥組(Icariin)：常氧+淫羊藿苷(100 μmol/L)處理RF/6A；缺氧組(Hypoxia)：缺氧處理RF/6A細胞；缺氧加藥組(Hypoxia+Icariin)：缺氧和Icariin一起處理RF/6A細胞。

1.2.2MTT檢測細胞增殖 各組細胞接種于96孔板中，淫羊藿苷處理24、48、72和96 h后分別加入MTT溶液孵育4 h，棄上清，然后加入DMSO振蕩10 min以溶解結晶物。最后570 nm處檢測吸光度值。

1.2.3Transwell檢測細胞侵襲 首先用無血清培養基將待測細胞制成1×106個/ml的細胞懸液。然后將細胞懸液加入鋪有人工基底膜的Transwell上室中，在下室中加入含20%胎牛血清的培養基，37℃培養24 h。接著用0.5%的結晶紫對上室底部細胞進行染色，并用棉簽除去上室內側的細胞。顯微鏡下觀察細胞并統計細胞數量。

1.2.4劃痕實驗檢測細胞遷移 將細胞密度為1×106個/ml的細胞懸液接種到6孔板中培養至形成單層細胞。在單層細胞上用10 μl的槍頭劃線，用PBS洗去因劃線而脫落的細胞。顯微鏡下觀察拍照，繼續培養24 h后再取出觀察拍照。

1.2.5蛋白印跡 用PBS漂洗細胞后加入含蛋白酶抑制劑的細胞裂解液進行裂解提取總蛋白，100℃變性5 min。等量蛋白進行SDS-PAGE凝膠電泳分離并轉至PVDF膜。經5%的BSA封閉1 h后加入對應的一抗，4℃過夜孵育。第二天加入辣根過氧化物酶標記的二抗，室溫孵育1.5 h。最后加入發光液后于凝膠成像儀進行曝光拍照并統計灰度值計算相對表達量

1.3統計學方法 用SPSS16.0軟件對實驗數據進行統計學分析，兩兩比較用獨立的t檢驗。P<0.05認為存在明顯差異，P<0.01認為存在顯著統計學意義，P<0.001認為存在極顯著統計學意義。

2 結果

2.1淫羊藿苷對缺氧誘導的RF/6A細胞形態和增殖的影響 顯微鏡下觀察發現，缺氧處理RF/6A后細胞數目增多，正常組和對照加藥組細胞數目無明顯變化，缺氧加藥組細胞數目少于缺氧組(圖2)。由圖3可知，缺氧組細胞增殖倍數明顯高于對照組(P<0.05)。與缺氧組相比，缺氧加藥組細胞增殖倍數明顯下降(P<0.05)。上述結果表明，淫羊藿苷可抑制缺氧誘導的RF/6A細胞增殖能力的提高。

2.2淫羊藿苷可降低缺氧誘導的RF/6A細胞侵襲能力的增強 利用Transwell檢測細胞侵襲，探究淫羊藿苷對缺氧處理的RF/6A細胞侵襲能力的影響。圖4顯示，正常組和對照加藥組平均每個視野下穿過基底膜的侵襲細胞數目無明顯差異。缺氧組侵襲細胞數目明顯多于正常組(P<0.05)。與缺氧組相比，缺氧加藥組侵襲細胞數目明顯變少(P<0.05)。由此可見，淫羊藿苷會逆轉缺氧造成的RF/6A細胞侵襲能力的升高。

2.3淫羊藿苷會減弱缺氧誘導的RF/6A細胞遷移能力的提高 為分析淫羊藿苷對缺氧處理的RF/6A細胞遷移能力的影響，劃痕實驗檢測細胞遷移。如圖5所示，正常組和對照加藥組劃痕愈合率無明顯變化。與正常組相比，缺氧組劃痕愈合率明顯上升(P<0.05)。但缺氧加藥組劃痕愈合率卻明顯低于缺氧組(P<0.05)。上述結果說明，淫羊藿苷抑制缺氧對RF/6A細胞遷移能力的增強作用。

圖2 RF/6A細胞形態Fig.2 Morphology of RF/6A cells

圖3 MTT檢測細胞增殖Fig.3 Cell proliferation was detected by MTTNote: *.P<0.05 vs normal group；#.P<0.05 vs hypoxia.

圖4 Transwell檢測細胞侵襲Fig.4 Cell invasion was detected by TranswellNote: *.P<0.05 vs normal group；#.P<0.05 vs hypoxia.

圖5 劃痕實驗檢測細胞遷移Fig.5 Cell migration was measured by wound healingNote: *.P<0.05 vs normal group；#.P<0.05 vs hypoxia.

圖6 蛋白印跡檢測VEGF通路相關蛋白表達Fig.6 Expression of VEGF related proteins were tested by Western blotNote: **.P<0.01,***.P<0.001 vs normal group,#.P<0.05 vs hypoxia.

2.4淫羊藿苷可抑制缺氧誘導的RF/6A細胞中VEGF通路的激活 為探索淫羊藿苷影響缺氧誘導的RF/6A細胞的分子機制，蛋白印跡檢測VEGF通路相關蛋白VEGF、p-PI3K、p-AKT和Rac的表達。圖6顯示，缺氧組VEGF、p-PI3K、p-AKT和Rac相對表達量顯著高于正常組(P<0.01)。與缺氧組相比，缺氧加藥組VEGF、p-PI3K、p-AKT和Rac表達明顯降低(P<0.01)。由此可見，淫羊藿苷可抑制缺氧引起的VEGF、p-PI3K、p-AKT和Rac蛋白水平的升高，從而抑制VEGF通路的激活。

3 討論

內皮細胞在血管新生過程中起著重要作用[7]。目前抗VEGF是眼部血管新生的標準治療策略，該治療策略已被廣泛應用于各種視網膜血管疾病，包括糖尿病視網膜病變和視網膜靜脈阻塞[8]。但這些抗VEGF藥物存在著一些眼部或全身性的副作用。天然產物因具有高化學多樣性和生物化學特性而受到了越來越多的關注。許多天然產物被認為具有成為抗血管新生的潛力，有利于血管新生相關疾病的治療[9]。

細胞增殖調控在各類疾病中起著重要作用[10]。目前發現了多種可以調節細胞增殖的植物提取物。有研究表明金銀花水提取物可減弱VEGF誘導的RF/6A細胞增殖[11]。Balaiya等[12]發現白藜蘆醇可抑制缺氧誘導的RF/6A細胞增殖。據報道淫羊藿苷會抑制低密度脂蛋白誘導的血管平滑肌細胞增殖[13]。在卵巢癌細胞A2780中，淫羊藿苷處理會降低細胞增殖能力[14]。有數據顯示淫羊藿苷具有抑制肝癌HepG2細胞增殖的功能[15]。Zhang等[16]發現淫羊藿苷可減弱膽囊癌GBC-SD 和 SGC-996細胞增殖。本研究結果顯示，淫羊藿苷可抑制缺氧對誘導RF/6A細胞增殖能力的增強作用。

越來越多的研究表明許多植物提取物具有抑制細胞侵襲的功效。有研究顯示野艾蒿提取物可減弱人臍靜脈內皮細胞侵襲[17]。Kim等[18]發現山紫菀乙醇提取物可降低人臍靜脈內皮細胞侵襲能力。據報道淫羊藿苷可抑制胃癌BGC-823細胞侵襲[19]。在惡性膠質瘤U87MG細胞中，淫羊藿苷處理會減弱侵襲能力[20]。有數據顯示淫羊藿苷可降低高轉移的肺癌細胞PG的侵襲能力[21]。本文結果表明，淫羊藿苷可抑制缺氧對RF/6A細胞侵襲能力的增強作用。

大量文獻報道了植物提取物可抑制細胞遷移。Li等[22]發現槲皮素可抑制VEGF誘導的RF/6A細胞遷移。有數據表明槲皮黃酮會以一種濃度依賴型的方式減弱RF/6A細胞遷移能力[23]。據報道山茶花果實提取物可降低血小板衍生因子BB誘導的血管平滑肌細胞遷移[24]。有研究發現淫羊藿苷可減弱食管鱗狀上皮細胞癌EC109 和TE1 ESCC細胞遷移[25]。在肺腺癌細胞A549中，淫羊藿苷可抑制細胞遷移[26]。本研究結果顯示，在缺氧誘導的RF/6A細胞中，淫羊藿苷處理會導致細胞遷移能力下降。

PI3K/AKT信號通路在各類疾病中發揮著重要作用[27-31]。據報道VEGF可通過PI3K/AKT信號通路調節RF/6A細胞增殖及血管形成[32]。Yu等[33]發現毛蘭素可降低高糖誘導的RF/6A細胞VEGF表達，減弱VEGF誘導的RF/6A細胞PI3K和AKT磷酸化水平的升高，抑制PI3K/AKT信號通路激活。有研究發現在人臍靜脈內皮細胞中，淫羊藿苷處理可降低VEGF的分泌[34]。據報道在食管癌細胞KYSE70中，淫羊藿苷處理會降低p-AKT蛋白水平，抑制PI3K/AKT信號通路的活化[35]。本文結果表明，淫羊藿苷可減弱缺氧誘導的RF/6A細胞VEGF、p-PI3K、p-AKT和Rac蛋白水平的升高，抑制PI3K/AKT通路的激活。

本研究表明，在缺氧誘導的RF/6A細胞中，淫羊藿苷會減弱細胞增殖、侵襲和遷移能力，降低VEGF、p-PI3K、p-AKT和Rac蛋白水平。綜上所述，淫羊藿苷可通過VEGF/PI3K/AKT通路抑制缺氧誘導的RF/6A細胞增殖、侵襲和遷移。下一步計劃通過體內實驗研究淫羊藿苷對視網膜血管新生相關疾病的影響。