miR-146b免疫學研究進展

薛慶節 張瑞華 熊化保③

(濟寧醫學院基礎醫學院,濟寧 272067)

miR-146家族包括兩個成員miR-146a和miR-146b，由兩個進化上保守的miRNA基因組成，在人類基因中它們分別由5號染色體和10號染色體上的不同基因轉錄,它們具有相同的必需序列，其成熟產物在3′端僅有2個核苷酸不同[1,2]。盡管它們的序列相似，但這兩個miR是否履行了多余或不同的功能還不清楚；另外，與miR-146a不同，miR-146b在免疫應答方面的生物學信息很少，只知道其與大多數腫瘤生物學密切相關，在許多人類實體瘤中以較低水平表達。

1 miR-146b的特點

一些研究表明其在惡性腫瘤中可作為轉移抑制因子，在許多類型的惡性腫瘤中可觀察到miR-146b的失調而導致腫瘤的惡化。miR-146b在先天免疫中具有重要作用，當用LPS作用時，miR-146b在人單核細胞系THP-1中的表達顯著增加。此外，3′-UTR熒光素酶報告實驗表明，TLR信號中間體IRAK1和TRAF6是miR-146b的作用靶點[3,4]。

在人類的3′-非翻譯區中，IRAK1和TRAF6同源基因均含有miR-146b的靶位點，表明miR-146b的TLR信號的反饋調控是進化保守的。最近的研究表明，microRNA參與免疫過程及其與炎癥性疾病的聯系，miR-146b被認為是哺乳動物先天和適應性免疫反應的一個調節劑。在斑馬魚miRNA表達譜芯片分析中，miR-146b家族成員miR-46b均被鼠傷寒沙門氏菌和海馬分枝桿菌誘導表達,miR-46b通常在胚胎和成年魚感染期間被誘導，這些microRNA在胚胎感染模型中的特異性與先天免疫反應聯系在一起，因為適應性免疫在發育早期尚未開始發育階段[5]。在鼠傷寒胚胎感染模型中敲除miR-46b對pro-炎癥基因的表達或對已知免疫應答介質的轉錄調控器和信號轉導元件的表達沒有重大影響。研究發現，miR-146b的感染誘導型表達受到通過MyD88-Traf6途徑的信號缺陷的影響；在用鼠傷寒沙門氏菌和海馬分枝桿菌感染斑馬魚期間誘導miR-146b；miR-146b的敲除不影響斑馬魚胚胎中的白細胞發育；在鼠傷寒沙門氏菌感染期間,miR-146b的組合敲除對促炎基因表達不產生明顯的影響[6]。

有證據表明，在促炎細胞因子在時，miR-146b可在內皮細胞中被誘導。盡管部分由EGR-3介導的miR-146b基因座的快速轉錄誘導，但與白細胞黏附分子的表達相比，miR-146b誘導延遲，并且與下游調節炎性基因表達，miR-146b抑制促炎性NF-κB途徑、MAP激酶途徑以及下游EGR轉錄因子密切相關[7,8]。因此，HuR是一種通過抑制內皮型一氧化氮合酶(eNOS)表達來促進內皮活化的RNA結合蛋白，是一種新型的miR-146b靶標。有關實驗證明，miR-146b可以抑制促炎細胞因子來刺激相應的內皮細胞因子激活的強度和持續時間[7]。重要的是，表達miR-146b的小鼠顯示白細胞黏附分子和趨化因子對IL-1b處理的誘導增強。miR-146b的抗炎活性是通過抑制促炎轉錄因子(即NF-κB，EGR-1/3，AP-1)以及通過調節轉錄后介導的促炎通路(由HuR的靶向介導)。當其他炎癥基因如VCAM-1，ICAM-1和SELE存在時，miR-146b水平在炎癥反應的晚期累積即使在沒有促炎癥細胞因子的情況下也能持續數天升高[8]。由于miR-146b抑制NF-κB和EGR途徑的活化，所以響應于促炎細胞因子的miR-146b誘導形成負反饋環以控制內皮活化。miR-146b的轉錄可維持在炎癥反應的后期，甚至在不存在細胞因子的情況下也維持轉錄。另外，在炎癥過程中控制miR-146b成熟的機制仍是未知的，考慮到miR-146b誘導的動力學，我們認為miR-146b可能在解決血管炎癥中起重要作用，并且miR-146b的表達時間延長是炎癥“記憶”的分子標記。在內皮細胞中，升高到一定水平的miR-146b可以促進細胞因子脫敏，由此最初的細胞因子治療減弱隨后對細胞因子暴露的應答強度[7,9]。

2 IL-10刺激誘導miR-146b表達

有證據表明，IL-10刺激誘導了miR-146b表達，并且在IL-10缺陷的巨噬細胞中miR-146b表達受損。研究數據表明miR-146b靶向基因IRF5，導致巨噬細胞活化的調節；此外，miR-146b缺陷型小鼠發生了M1型巨噬細胞極化增強的腸道炎癥[10]。最后，miR-146b模擬物處理可顯著抑制M1巨噬細胞活化并改善體內結腸炎發展。總之，IL-10依靠miR-146b在調節M1巨噬細胞中起重要作用。

Curtale等[10,11]報道，LPS通過IL-10依賴性誘導miR-146b的表達，并顯示miR-146b通過直接靶向TLR4信號傳導途徑在人單核細胞中起抗炎作用IL-10或LPS刺激誘導巨噬細胞中的miR-146b表達，并且在IL-10缺陷的巨噬細胞中miR-146b的表達受損。此外，RNA免疫共沉淀實驗顯示，miR-146b和IRF5可以占據相同的miRNA誘導沉默復合物(miRISC)。此外，miR-146b類似物顯著降低由LPS誘導的IRF5 3′UTR活性和IRF5蛋白表達，miR-146b缺陷小鼠表現出增強的M1巨噬細胞極化[12]。最后，用miR-146b模擬物處理可顯著抑制M1巨噬細胞活化并改善結腸炎發展。

總之，研究結果表明IL-10-miR-146b-IRF5集合在M1巨噬細胞活化的調節中起重要作用，并強調了miR-146b在控制免疫應答中的作用。另外，Curtale等[10]已經證明LPS通過IL-10依賴性途徑誘導miR-146b的表達，通過直接與多靶點的結合(包括TLR4，MyD88，IRAK1和TRAF6)來調節TLR4信號傳導途徑。人單核細胞中miR-146b的表達導致LPS誘導產生的促炎細胞因子和趨化因子的顯著降低。在本研究中，發現在用LPS刺激后，在小鼠M1巨噬細胞中可誘導miR-146b產生，但在IL-10缺陷細胞中miR-146b表達卻受損。更重要的是，通過抑制M1巨噬細胞標記基因表達，miR-146b顯著抑制M1巨噬細胞分化。

此外，我們確定了miR-146b靶向IRF5，這是M1巨噬細胞分化的關鍵轉錄因子，miR-146b缺陷小鼠表現出增強的M1巨噬細胞極化[13,14]。因此可以得出這樣的結論，IL-10誘導miR-146b的表達，其靶向IRF5以調節M1巨噬細胞分化。在本研究中，我們發現在患有結腸炎的IL-10缺陷型小鼠中miR-146b表達顯著降低，這促使我們在IL-10-/-小鼠中嘗試用miR-146b類似物來治療結腸炎。有趣的是，與對照相比，用miR-146b類似物處理可有效地改善IL-10-/-小鼠的結腸炎癥狀，可能是通過抑制M1巨噬細胞的分化[13,15]。

3 miR-146b控制M1巨噬細胞的作用

研究顯示miR-146b可以控制M1巨噬細胞活化并改善結腸炎發展，在M1巨噬細胞中IL-10依賴性miR-146b的表達可調節巨噬細胞表型的形成[14,15]。miR-146b靶向IRF5進而調節M1巨噬細胞分化的新機制，用miR-146b類似物處理可明顯改善結腸炎的發展，并通過在體外和體內抑制M1巨噬細胞激活標記基因的表達來抑制M1巨噬細胞活化[14]。總之，研究結果進一步證實了IL-10依賴miR-146b在M1巨噬細胞活化的調節中起重要作用，且特別顯示了miR-146b在控制炎性疾病的免疫應答和發病機制中的有效作用。

前期研究表明，在LPS進入機體后，單核細胞通過IL-10介導的STAT3依賴性上調miR-146b的表達。研究顯示miR-146b通過直接靶向多種元件，包括LPS受體TLR4，白細胞介素-1受體相關激酶1(IRAK-1)和TNF受體相關因子6(TRAF6)[13]。此外，在人單核細胞中表達miR-146b導致LPS依賴性的幾種促炎細胞因子和趨化因子(包括IL-6、TNF-α、IL-8、CCL3、CCL2、CCL7和CXCL10)的明顯降低。因此，miR-146b作為IL-10響應性miR具有抗炎活性基于單核細胞中的TLR4途徑多靶向組成和作為IL-10抗炎癥反應的分子效應物；IL-10在人單核細胞中可誘導MiR-146b的表達；TLR4是miR-146b的直接靶標[12,13]。miR-146b對TLR信號通路的多靶點研究miR-146a是第一個與炎癥反應相關的miR，被認為是由吞噬細胞中的促炎刺激物快速誘導的miR,各種實驗已明確了它在炎癥反應調節中的作用以及其參與的內毒素耐受。

miR-146b的誘導取決于LPS注射后產生的IL-10的活性，而相反，IL-10不影響miR-146a表達。這與STAT3在miR-146b的誘導中發揮重要作用的ChIP數據是一致的，而miR-146a依賴于NF-κB。生物信息學分析也揭示了在TLR信號傳導、IL-1信號傳導和NF-κB信號傳導途徑中miR-146b顯著富集，并在先天免疫反應中驅動轉錄激活編碼促炎細胞因子和共刺激分子，然后控制抗原特異性適應性免疫應答的激活[16]。

需要進一步的研究來了解miR-146b是否真正起到參與炎癥消退的分子開關的作用，但有趣的是已有報道稱這種miR已經在急性炎癥的小鼠模型的愈合階段表達。對miR-146b如何在涉及多受體信號傳導的復雜炎癥過程的背景下與越來越多的負調控因子協同作用，對其更廣泛、更深入地理解，可能有利于新的治療方法的發現，以治療失控的炎癥反應引起的多種疾病。

4 miR-146b與DC的凋亡和細胞因子的產生

miR-146b在人DC分化和功能中作用有三個重要特點：首先，miR-146b的表達在人單核細胞向imDCs和mDC分化過程中上調[16]，在人DC分化過程中miR-146b的表達增加與TRAF6和IRAK1表達顯著呈負相關。其次,miR-146b可能是DC凋亡和細胞因子產生的關鍵調節因子。miR-146b顯著促進DC凋亡并抑制IL-12、p70、IL-6和TNF-α的產生。mDCs中miR-146b的沉默可導致DCs分泌更高水平的IL-12、p70以及增加NK細胞產生IFN的能力。另外，在機理上，miR-146b靶向TRAF6和IRAK1，導致NF-κB的抑制并減少Bcl-2表達[16,17]。

因此，現已證實miR-146b可調節人DC凋亡和細胞因子的產生，miR-146b在控制免疫反應過度刺激中具有新的負反饋機制。已確定TRAF6和IRAK1是TLR或細胞因子受體/NF-κB信號通路中的兩個關鍵銜接分子，它們是miR-146b通過負反饋調節的直接靶點。然而，在兩種人類骨髓細胞系(THP-1和HL-60)中，用LPS處理8 h后，僅檢測到前體和成熟形式的miR-146a上調，而miR-146b沒有上調。最近的一項動力學研究表明，LPS刺激的人原代單核細胞中miR-146a的誘導速度比miR-146b快，在刺激后12 h才可以檢測到其對miR-146b的誘導作用[18]。相反，在我們的研究中，miR-146b在單核細胞向imDCs和mDCs分化過程中上調，而且都參與了通過細胞凋亡終止DC功能和抑制細胞因子的產生。

miR-146b調節DC凋亡的機制是通過miR-146b-TRAF6/IRAK1-NF-κB途徑，miR-146b在DC成熟過程中的上調與TRAF6和IRAK1表達呈負相關。miR-146b的過表達或TRAF6和/或IRAK1的沉默導致DC中IB表達顯著增加。這些發現都支持miR-146b作為NF-κB的負調節因子下調TRAF6和IRAK1功能的觀點[10，17]。因此，miR-146b可調節細胞存活，miR-146b是單核細胞來源的DC存在的關鍵調節因子。

圖1 miR-146a/b調控DC的功能(引自：Haein Park等[19])Fig.1 Regulation of DC′s function by miR-146a/b(from Haein park et al[19])

miR-146b誘導DC成熟并導致其凋亡，降低細胞因子的產生，miR-146b可以作為調節機制來防止過度刺激的人類DC中的炎癥反應。有人使用信息軟件進行計算搜索，發現CD40LG、TLR4、FADD，FAS和SMAD4是miR-146b的預測靶目標。據報道，CD40L可增加DC存活量,上調MHC表達，并誘導DCs中多種細胞因子如IL-12的表達[18]。通過miR-146b介導的沉默，由DC產生的IL-12和由IL-12介導由NK細胞產生的IFN-γ顯著增強。

因此，CD40L可能成為miR-146b靶向DC凋亡和細胞因子產生的靶點。CD40L或其他靶分子是否在miR-146b介導的DC凋亡和細胞因子產生中發揮作用，還需要進一步研究，miR-146b在DC存活和炎癥激活的調節中起關鍵作用。miR-146b可能需要對DC凋亡實現具有累加效應，因為每個個體miRNA都可以作為一個微調器。未來的研究也需要進一步明確miR-146b介導的DC凋亡在體內自身耐受和自身免疫中的精確作用。這些發現可能通過控制DC中的miR-146b-TRAF6/IRAK1-NF-κB途徑對自身免疫疾病和/或癌癥具有治療意義。

5 miR-146b的表達與人類疾病

miR-146b通過NF-κB和EGR通路來抑制血管炎癥，從而在動脈粥狀硬化的形成中發揮重要作用[20，21]。我們認為HuR為miR-146b的新的作用位點，HuR在IL-1b產生中促進內皮細胞活化和白細胞募集，但HuR蛋白水平在內皮細胞激活的晚期降低，表明在這個階段的miR-146b上調可能抑制HuR，從而形成負反饋環。因此，MiR-146b通過協同抑制黏附分子的誘導(通過TRAF6/IRAK1/2靶點)和通過白細胞黏附抑制劑eNOS(靶點為HuR)的表達來抑制內皮激活[13,22]。

這些研究結果表明miR-146b為內皮細胞中的microRNA介導的NF-κB調節網絡一部分。除了調節NF-κB途徑，miR-146b還導致調控炎性基因表達的EGR和AP-1途徑的活化[23]以及miR-146b直接與HuR的結合，進而通過拮抗eNOS的表達來促進內皮細胞的活化。這意味著miR-146b可能比miR-10a、miR-31、miR-17-5p或miR-181b具有更廣泛的抗炎作用[24,25]。因此，增加血管中的miR-146b的對于抑制血管內皮細胞對炎性細胞因子的反應可能是有用的，并且可能用于抑制導致動脈粥樣硬化的炎癥或治療在敗血癥中與細胞因子有關的血管損傷。

這可能與這些細胞系中miR-146b的調節不同有關，已經在許多類型的惡性腫瘤中觀察到miR-146b的失調，并且一些研究暗示這些miRNA作為轉移抑制因子[2,7]。Taganov等[24]研究發現，當人的機體注射LPS時，miR-146b在人單核細胞THP-1細胞系中的表達增加。此外，3′-UTR螢光素酶報告基因檢測證實，TLR信號傳導中間體IRAK1和TRAF6是miR-146b的潛在作用靶點。

6 miR-146b的表達與癌癥

在不同類型的癌癥(包括PTC)中觀察到miR-146b的不同程度的過表達，PTC中miR-146b的高表達與癌癥臨床病理相關研究中的惡性程度和侵襲性呈正相關[25-27]。此外，與miR-146b水平較低的患者相比，更高的miR-146b表達水平的總體生存率明顯較差[28]。我們假設FNA中的miR-146b可以將PTC與良性甲狀腺腫塊區分開來，并探討miR-146b在甲狀腺結節初始外科治療中的影響。進一步探討miR-146b表達與關鍵臨床病理指標之間的聯系，評估miR-146b在預測PTC侵襲和轉移的潛在用途以及進一步評估miR-146b在甲狀腺FNA細胞學中的診斷效用。有關數據表明，由于miR-146b在惡性和良性病變之間呈顯著增加的表達，所以其具有良好的臨床診斷潛力[29]。

FNA與miR-146b之間的準確性差異可能反映了miR-146b對PTC具有較強的診斷價值。在晚期疾病階段的PTC標本中miR-146b表達顯著增加，表明其可能是PTC有用的預后標記物。此外，PTC細胞中miR-146b的表達增加與向局部淋巴結或遠端器官的轉移有關，進一步指出miR-146b的增加參與了PTC的侵襲和轉移[29,30]。這項工作代表了生物醫學科學的進步，因為它表明miR-146b可用于提高FNA活檢的診斷準確性，并將PTC與良性甲狀腺瘤分開，可能成為其干預及治療的潛在目標。

研究發現miR-146b的表達水平與PTC的發生密切相關，這表明調節miR-146b的表達可能是抗癌的有效治療策略，正常或低表達miR-146b的患者預后明顯優于高表達患者[31-33]。研究miR-146b的表達與PTC臨床病理特征之間的關系發現miR-146b的表達與PTC的轉移和復發密切相關(P<0.01)。miR-146b可能通過影響乳頭狀甲狀腺癌細胞的增殖和遷移能力而導致PTC的復發和轉移。目前有證據表明miR-146b主要參與炎癥過程[34,35]。因此,這兩個基因對炎癥的調控也可能影響PTC的進展。Western blot分析顯示，miR-146b可顯著增加IRAK1的表達。其他研究人員發現，miR-146b可以上調IRAK1的表達，并在卵巢癌的炎癥反應中起作用[36,37]。然而現在對miR-146b調控IRAK1蛋白表達及其對PTC發生和預后的影響機制尚不清楚。總之，miR-146b在PTC癌組織中高度表達；并且患者的預后與兩種miRNA在癌細胞中的表達水平相關。miR-146b的表達應作為PTC篩查的分子標記，miRNAs可為PTC的臨床治療提供新的靶點。

7 小結

從miR-146b的產生、作用機制、信號通路以及在相應疾病中的作用中，我們可以看出miR-146b與各種疾病的作用密切相關，通過對miR-146b調節和控制可進一步調控各種疾病的發生和發展，為臨床提供思考和借鑒。