雙氫青蒿素聯合奧沙利鉑對人結腸癌HCT116細胞的增殖及凋亡的影響

李 霽，劉丹丹，周峰旭，李凌晨，納 鑫

昆明醫科大學藥學院暨云南省天然藥物藥理重點實驗室，昆明 650500

結腸癌的死亡率位居我國惡性腫瘤的第三位，結腸癌治療采用手術為主，化療為輔的方法進行治療。奧沙利鉑(Oxaliplatin,L-OHP)是治療結直腸癌的一線藥物，已應用多年，但因易產生多藥耐藥及發生末梢神經炎而限制了其使用[1，2]。青蒿素為我國首次從黃花蒿中提取的一種高效低毒的抗瘧藥，研究發現青蒿素及衍生物除具有抗瘧作用外，還具有抗病毒和抗腫瘤作用。Efferth等[3]對55個腫瘤細胞株研究發現結腸癌等腫瘤細胞對青蒿素類化合敏感，雙氫青蒿素(Dihydroartemisinin，DHA)為青蒿素類化合物在體內的主要活性代謝產物，與其他青蒿素類藥物相比顯示出較強的抗腫瘤活性且毒性較低[4,5]。因此本研究將雙氫青蒿素和奧沙利鉑聯合應用，觀察體外兩藥聯合對結腸癌細胞株HCT116增殖和凋亡的影響，為雙氫青蒿素抗腫瘤的臨床應用提供依據。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

雙氫青蒿素(Fluka公司，美國)；奧沙利鉑(江蘇恒瑞醫藥股份有限公司，中國)；RPMI 1640培養基(GIBCO公司，美國)；胎生牛血清(GIBCO公司，美國)；二甲基亞砜(Amresco公司，美國)；二甲基四氮唑藍(Amresco公司，美國)；十二烷基硫酸鈉(北京鼎國生物技術有限公司，中國)；異丁醇(上海化學試劑公司生產，中國)；濃鹽酸(成都市欣海興化工試劑廠，中國)；Annexin V-FITC(欣博盛公司，中國)；Bax、Bcl-2抗體(Abcom公司，英國)。

1.2 儀器與設備

酶標儀(Molecular Devices公司，美國；型號Plus384)；倒置顯微鏡(OLYMPUS公司，日本；型號CKX31)；流式細胞儀(Beckman公司，美國；型號Coultet FCS500)；CO2培養箱(Hereaus公司，德國；型號3111.REL#5)

1.3 細胞培養

HCT116細胞(Hunman colon tumor-116)保存于云南省天然藥物藥理重點實驗室，于10%新生牛血清RPMI1640培養液中，5% CO2，37 ℃孵育培養。

1.4 MTT測定細胞增殖抑制率

取對數期的細胞接種于96孔培養板中，每孔含細胞8×103個，培養12小時后加入DHA，L-OHP，每組樣本設3個復孔，空白對照組加入等體積的AS，溶媒對照組0.5%DMSO。48小時后，每孔加入MTT溶液(5 mg/mL)20 μL,于37 ℃繼續孵育4 h終止培養，加入三聯液100 mL，過夜后比色，選擇570 nm和630 nm為測定波長，在酶聯檢測儀雙波長法上測定每孔吸光度(OD)，記錄結果。抑制率=(1-實驗組OD/空白組OD)×100%。

1.5 聯合用藥藥效評價

采用金正均Q值法分析兩藥聯合效應，公式Q=Ea+b/(Ea+Eb-Ea×Eb)，其中Ea、Eb表示a、b兩藥單獨作用時的細胞抑制率，Ea+b表示兩藥聯合作用時的細胞抑制率，式中分母表示“期望合并效應”，分子表示“實測合并效應”，Q值為二者的比值，Q<0．85表示兩藥聯用為拮抗作用，0.85≤Q≤1.15為相加作用，Q>1.15為協同作用。

1.6 AnnexinV-FITC/PI雙染檢測細胞凋亡

藥物作用48小時后，用0.5%胰酶消化細胞，各組樣本細胞用冷PBS洗滌二次，并在染色緩沖液中以1×106細胞/ml的濃度重懸。吸取100 μL的細胞至試管中，加入適量熒光標記的Annexin-V和PI。按照說明書提示濃度操作，混勻后避光室溫下孵育10 min。孵育后加入300 μL染色緩沖液，立即上流式細胞儀分析，實驗重復3次。

1.7 caspase-3，caspase-8活性檢測

取對數生長期HCT116細胞，用DHA(10 μmol/L) ，L-OHP(0.02 μmol/L) ，DHA(10 μmol/L) +L-OHP(0.02 μmol/L)聯合，設定空白對照組，分別誘導24 h后，收集細胞。加入100 μL 裂解緩沖液，渦旋振蕩。然后置于冰上15 min，每5 min 渦旋振蕩一次。在4 ℃，500×g下離心5 min，取上清液。對上清液用考馬斯亮藍法進行蛋白定量。取10 μmol/L(大約含20～50 μg) 蛋白的上清液，加入90 μL檢測緩沖液和10 μL Ac-DEVD-pNA，在37 ℃避光反應1～2 h，出現黃色時檢測其活性。在酶標儀上選擇450 nm波長測定吸光度。根據凋亡誘導的細胞的吸光度與空白對照細胞的吸光度的比值計算相對的caspase-3，caspase-8 的活性程度。

1.8 Western blot分析

對數生長期的細胞，按試驗要求處理后，收集細胞，PBS洗滌3次，加入細胞裂解液，100 μL,14 000 rpm離心10 min，蛋白定量，取40 μg蛋白加入上樣緩沖液，95 ℃下10 min。l0%的聚丙烯酰胺SDS凝膠電泳后轉移至硝酸纖維膜上，5%脫脂牛奶封閉后依次加入第一、二抗體，室溫下孵育2 h，TBST緩沖液洗滌3次，加入化學發光劑，放人暗盒中并壓片，2～5 min后顯影、定影。

1.9 單細胞凝膠電泳實驗

(1)將處于對數生長期的HCT116細胞，接種于六孔板中，接種密度為5×105個/孔。CO2培養箱中培養4 h。重懸于冷PBS中，并調整細胞濃度為5×103個/mL，置于冰上待用。(2)制備1%常溫熔點瓊脂糖凝膠，將凝膠涂布于載玻片上，涂布厚度約為0.5 mm，并將制備好的凝膠置于4 ℃冰箱中冷卻凝固。同時制備1%低熔點瓊脂糖凝膠，最后再在上層涂布一層常溫熔點瓊脂糖凝膠，形成一個“三明治凝膠”。加入0.5X TBE 電泳緩沖液，30 V ,電泳15 min。最后置于Du red染色液中染色1 h，置于熒光顯微鏡下，采用CASP彗星分析軟件分析。

1.10 統計學分析

2 實驗結果

2.1 DHA與L-OHP聯合對HCT116人結腸癌細胞增殖的抑制作用

L-OHP與DHA單獨和聯合使用對HCT116人結腸癌細胞增殖的抑制作用，單獨使用L-OHP或DHA對HCT116細胞均具有明顯的增殖抑制作用，并具有一定的量效關系。在DHA10 μmol/L與L-OHP 0.01、0.02、0.04、0.08、0.16 μmol/L濃度對HCT116人結腸癌細胞進行聯合應用，結果顯示其抑制率分別達到49.39%、64.99%、73.48%、75.21%、77.49%，比兩藥單獨使用抑制率顯著提高，結果有統計學意義，(**P<0.01)(見表1)。

2.2 金正均Q值進行聯合用藥作用分析

DHA在10 μmol/L濃度下，L-OHP在0.01 μmol/L、0.02 μmol/L、0.04 μmol/L濃度下Q>1.15，兩藥聯合應用可表現出明顯的協同作用。而DHA在10 μmol/L濃度，L-OHP在0.08 μmol/L、0.16 μmol/L濃度下Q值在0.85～1.15之間，兩藥聯合應用表現出相加作用(見表1)。

表1 DHA、L-OHP及聯合用藥對HCT116細胞的抑制率Table 1 Inhibitory effects of DHA and L-OHP and combination on HCT116

注：與10 μmol/L DHA組比較*P<0.05；**P<0.01。與同濃度的L-OHP組比較,#P<0.05；##P<0.01。Q<0.85表示兩藥聯用為拮抗作用，0.85≤Q≤1.15為相加作用，Q>1.15為協同作用。
Note:Compared with 10 μmol/L DHA group*P<0.05;**P<0.01.Compared with the same concentration of L-OHP group,#P<0.05;##P<0.01.Q<0.85 indicates that the two drugs are combined for antagonism,0.85≤Q≤1.15 for additive effect,and Q>1.15 for synergistic effect.

2.3 DHA與L-OHP聯合應用對HCT116細胞凋亡的影響

DHA與L-OHP單獨和聯合作用于結腸癌細胞HCT116 48小時后，對照組凋亡率為3.91%；DHA組在10 μmol/L濃度下凋亡率為19.14%；L-OHP組在0.02 μmol/L濃度下凋亡率為27.31%；兩藥聯合組凋亡率為35.52%比DHA組和L-OHP組均較高，(**P<0.01)(見圖1)。

2.4 Western-blot檢測Bcl-2及Bax蛋白

Western-blot檢測Bcl-2及Bax蛋白，結果顯示，DHA組、L-OHP 組以及DHA、L-OHP聯合組作用HCT116細胞24 h后，檢測Bcl-2/Bax蛋白變化，DHA 、L-OHP聯合組與DHA組比較，Bcl-2/Bax降低，**P<0.01 ,DHA 、L-OHP 聯合組與L-OHP 比較，Bcl-2/Bax降低，(##P<0.01)(見圖2)。

2.5 Caspase-3，Caspase-8 活性檢測

對給藥后的Caspase-3，Caspase-8進行活性檢測，結果顯示，DHA組、L-OHP組以及DHA、 L-OHP聯合組作用HCT116細胞24h后，DHA、L-OHP 聯合組的Caspase-3 活性顯著提高，與DHA組和L-OHP組比較有統計學意義P<0.01。DHA組、L-OHP 組以及DHA、L-OHP 聯合組作用HCT116細胞24 h后Caspase-8顯著提高，與DHA組及L-OHP組比較DHA、L-OHP聯合組caspase-8顯著提高與L-OHP組比較P<0.05，與DHA組比較P<0.01(見圖3)。

圖1 DHA 與L-OHP聯合對HCT116細胞凋亡的影響Fig.1 Effect of DHA combined with L-OHP on apoptosis of HCT116 cells注：與DHA組比較*P<0.05；**P<0.01，與L-OHP組比較,#P<0.05。Note：Compared with DHA group *P<0.05;**P<0.01,compared with L-OHP group, #P<0.05.

圖2 DHA與L-OHP聯合對HCT116細胞凋亡相關蛋白的影響Fig.2 Effect of DHA combined with L-OHP on apoptosis-related proteins in HCT116 cells注：與DHA組比較，**P<0.01；與L-OHP組比較，##P<0.01。Note：Compared with DHA group,**P<0.01;compared with L-OHP group,##P<0.01.

2.6 單細胞凝膠電泳實驗

給藥后進行單細胞凝膠電泳實驗，結果顯示，DHA組、L-OHP組以及DHA、 L-OHP聯合組作用HCT116細胞后，DHA、L-OHP聯合組的慧尾率顯著提高，與DHA組和L-OHP組比較有統計學意義(P<0.01和P<0.05)(見圖4)。

3 討論

奧沙利鉑是臨床上一線的治療結直腸癌的抗腫瘤藥物，抗腫瘤作用顯著，但奧沙利鉑長時間大量使用會產生腎毒性、耳毒性、神經毒性等毒副反應，腫瘤細胞對奧沙利鉑的耐藥性產生降低了奧沙利鉑的療效，是目前腫瘤化療失敗的重要原因[6]。因此利用毒性較低的具備抗腫瘤活性的化合物使化療藥物增敏從而減少化療藥物用量是一種提高抗腫瘤藥物化療作用降低毒性的重要方法。青蒿素類藥物毒性小對包括結腸癌在內的多種腫瘤有效，有研究報道其甚至可以逆轉結腸癌的耐藥[7，8],因此本研究將雙氫青蒿素與奧沙利鉑聯用觀察其對結腸癌細胞HCT116的抑制作用，計算藥物聯用是否有協同效應，對其凋亡及相關蛋白進行研究，為青蒿素類藥物進入抗腫瘤的臨床治療提供依據。

圖3 DHA與L-OHP聯合用藥對HCT116細胞凋亡相關蛋白活性的影響Fig.3 The effects of DHA and L-OHP on activity of apoptosis-related proteins注：檢測caspase-3活性，與DHA組比較，**P<0.01；與L-OHP組比較，##P<0.01；檢測caspase-8活性，與DHA組比較，**P<0.01；與L-OHP組比較，#P<0.05。Note：Detection of caspase-3 activity,compared with DHA group,**P<0.01;compared with L-OHP group,##P<0.01;detection of caspase-8 activity,compared with DHA group,**P<0.01;and Compared with L-OHP group,#P<0.05.

圖4 DHA與L-OHP聯合用藥對HCT116細胞DNA損傷的影響Fig.4 The effects of DNA damage on DHA and L-OHP注：與DHA組比較，**P<0.01；與L-OHP組比較，#P<0.05。 Note：Compared with DHA group,**P<0.01;compared with L-OHP group,#P<0.05.

L-OHP與DHA單獨和聯合使用對HCT116人結腸癌細胞增殖均有抑制作用，聯合用藥抑制率比兩藥單獨使用抑制率提高，應用金正均Q值法進行聯合用藥分析發現兩藥聯合使用在一定濃度下發揮協同作用，而在L-OHP相對較高的濃度下只發生相加作用。DHA可誘導DNA氧化損傷，而L-OHP抗腫瘤的主要機制是與腫瘤細胞DNA形成鏈內、外交聯，影響DNA的復制和轉錄[9，10]。DHA與L-OHP二者都能通過影響腫瘤細胞的DNA來發揮抗腫瘤作用，通過DNA損傷實驗發現，在DHA與L-OHP聯合應用后DNA損傷加重，影響腫瘤細胞的增殖，甚至可能進一步引起細胞凋亡。

觀察DHA與L-OHP聯合應用對HCT116細胞凋亡作用發現，與單藥組比較兩藥聯合應用凋亡率顯著提高，有研究顯示DHA能促進腫瘤細胞凋亡并對多種腫瘤有殺傷作用[11，12],研究表明DHA與順鉑聯用可提高抗腫瘤細胞的作用[13]，L-OHP也可引起多種腫瘤細胞凋亡，并且可通過Fas/FasL和caspase-8誘導細胞凋亡[14，15]。凋亡是多基因多因素相互之間影響和調控的結果。Bcl-2 基因是重要的凋亡抑制基因,Bcl-2 /Bax比值決定細胞是否進入凋亡狀態，若Bax越高，Bcl-2就被抑制，細胞凋亡被誘導,反過來Bax受抑，細胞得以生存[16]。研究顯示兩藥聯用Bcl-2 /Bax顯著降低，誘發凋亡，Bax 是Bcl-2家族成員，其可通過活化Caspases促進凋亡。Caspases 是凋亡信號轉導的共同通路，其中Caspase-3是核心效應器，負責對凋亡途徑最后執行階段的全部或部分關鍵性蛋白的酶切，可引發瀑布式激活下游的Caspase 蛋白酶家族，最終誘導細胞凋亡[6],本研究結果顯示兩藥聯合應用可顯著提高Caspase-3的活性，同時也提高Caspase-8的活性，從而誘導HCT116細胞的凋亡。

綜上所述，本研究發現雙氫青蒿素及奧沙利鉑可抑制HCT116結腸癌細胞的增殖作用，二者聯用在一定濃度下可對HCT116結腸癌細胞發揮協同作用，顯著提高抑制率。同時可通過下調Bcl-2/Bax表達比值，激活Caspase-3、Caspase-8的活性，促進HCT116結腸癌細胞凋亡。兩藥聯合可促進DNA損傷加重，抑制腫瘤細胞生長，其協同作用發生的具體靶點和機制，有待進一步研究。