益母草抗結核分枝桿菌成分的跟蹤分離

韓立芬，宋善敏，甘夢蘭，王仁鳳，楊再昌

貴州大學藥學院，貴陽 550025

結核(tuberculosis,TB)是結核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis,MTB)引起的可侵犯全身各器官的一種慢性傳染病。結核分為肺結核和肺外結核，其中女性盆腔結核近年來有增長的趨勢[1，2]。女性盆腔結核是指女性盆腔包括盆腔生殖器官(卵巢、輸卵管、子宮)及盆腔腹膜與子宮周圍的結締組織的炎癥。患者可出現消瘦、疲勞、發燒、出汗、乏力等癥狀，常伴隨盆腔痛、月經異常、痛經、閉經、月經量少等癥狀，是導致女性不孕的重要原因[3-6]。目前，主要使用抗癆藥物對女性盆腔結核實施治療,一線抗結核藥物缺乏子宮靶向性，必須長期服藥,由于這類藥物肝毒性明顯,患者往往不能堅持服藥,導致治療失敗。因此，研發子宮靶向性的抗結核新藥對盆腔結核的治療具有重要意義。

益母草是唇形科益母草屬植物益母草(Leonurusartemisia(Laur.)S.Y.Hu F)的新鮮或者干燥地上部分。古代文獻將益母草的功效歸屬于治療婦產科疾病，比如：《本草衍義補遺》說“益母草治產前產后諸疾”、《本草綱目》說“益母草治婦人胎產諸病”、《本草蒙筌》說“益母草總調胎產諸證”、《本草求真》說“益母草消水行血，去瘀生新，調經解毒，為胎前胎后要劑”。在現代醫學實踐中，益母草被制成“益母草膏”、“益母草顆粒”、“益母草注射液”等劑型 ，用于治療痛經、閉經、子宮陰道出血，具有促進產后子宮復舊及清理產后子宮殘留物等功效[7-14]。可見，益母草對子宮及其附件的多種病理過程具有明顯的干預作用，那么，益母草是否具有子宮靶向性、是否具有抗子宮結核的作用？迄今少見相關的文獻報道。

為發現具有子宮靶向性的抗結核藥物，我們對20多種具有治療女性盆腔類疾病的中草藥進行了抗結核桿菌體外試驗，部分品種顯示出抗結核桿菌活性，其中益母草乙醇提取物在改良羅氏培養基中能抑制結核分枝桿菌生長。對益母草進行抗結核分枝桿菌活性跟蹤分離，得到活性單體YMC04，報道如下。

1 材料與方法

1.1 藥材

益母草(2 700 g)購自貴陽市和平藥房，為除根外的細葉益母草全株。

1.2 儀器與試劑

核磁共振數據用INOVA400 MHz型超導核磁共振儀測定，TMS作內標；質譜數據用HP-5973型質譜儀測定；柱色譜用硅膠(200～300目)、硅膠H和薄層色譜用硅膠GF254均為青島海洋化工產品；改良羅氏培養基基礎(上海博微生物科技有限公司)，7H9肉湯(Difco)，其余試劑均為國產分析純。

1.3 益母草的提取與活性跟蹤分離

1.3.1 益母草的提取與分段

益母草樣品2 700 g用80%的乙醇加熱回流提取三次，每次一小時，合并提取液，過濾，置于70℃水浴蒸干，得乙醇提取物浸膏140 g。浸膏用10%乙醇水溶液溶解，再依次用石油醚、乙酸乙酯和二氯甲烷萃取，得到石油醚部位(45 g)、乙酸乙酯部位(40 g)、二氯甲烷部位(8 g)、剩余物(49 g)，不同萃取部位用改良羅氏培養基絕對濃度法進行活性跟蹤，發現乙酸乙酯、二氯甲烷萃取部位能抑制結核桿菌，乙酸乙酯萃取部位活性更強，因此將乙酸乙酯萃取部位視為有效部位。

1.3.2 益母草乙酸乙酯萃取部位的活性跟蹤與分離

乙酸乙酯萃取部位用硅膠柱色譜(200～300目)分離，干法裝柱，洗脫劑為石油醚：乙酸乙酯(4∶1～3∶2)進行梯度洗脫，最后甲醇沖柱，經TLC檢測，合并相似成分,得到六個組分(Fr.A、Fr.B、Fr.C、Fr.D、Fr.E、Fr.F)(圖1)。利用改良羅氏培養基進行活性跟蹤，發現有效組分為Fr.C(22-33)。

圖1 益母草乙酸乙酯萃取部位的分離Fig.1 Separation of ethyl acetate extract from Leonurus artemisia (Laur.)S.Y.Hu F

1.3.3 Fr.C的活性跟蹤與分離

Fr.C進行硅膠柱色譜(200～300目)分離，用二氯甲烷：甲醇(20∶1～15∶1)作洗脫劑進行梯度洗脫，得到四個組分(Fr.1、Fr.2、Fr.3、Fr.4)(圖2)。

利用改良羅氏培養基進行活性跟蹤，有效組分為Fr.2。Fr.2經硅膠柱色譜多次純化，得到單體YMC04(化合物1，400 mg)。

1.4 抗結核分枝桿菌測試絕對濃度法

改良羅氏培養基 40.84 g，加入12 mL的甘油，加蒸餾水600 mL煮沸5～10 min，115 ℃滅菌 20 min，待冷至55 ℃左右時以無菌操作加入1 000 mL無菌攪勻的全蛋液，混勻，分裝在15 mm×150 mm 的試管，每管5 mL[15]。稱取樣本，用二甲基亞楓(DMSO)溶解，分別加入到含有改良羅氏培養基試管中，根據預實驗確定濃度，每個濃度做3管，平行做2次，陽性對照為異煙肼(2 μg/mL)，陰性對照為含5% DMSO的無藥培養基，放置成斜面，80 ℃下加熱滅菌1 h，隔夜后相同條件下加熱滅菌1 h，冷卻后接種H37Rv菌懸液(108CFU/mL) 20 μL，使菌液由上往下分布在培養基斜面上，置 37 ℃的電熱恒溫培養箱中培養20天。在培養期間，每天觀察記錄一次。結果判斷：菌落數低于5個(含5個)視為有效，其中菌落0～1個記“+++”，2～4個記“++”，5個記“+”，菌落數在6個以上(含6個)視為無效，記“-”。

圖2 Fr.C的分離Fig.2 Separation of Fr.C

2 結果

2.1 活性跟蹤

采用改良羅氏培養基絕對濃度法對益母草乙醇提取物不同萃取部位進行活性測試，結果見表1，可見活性最強的部位為乙酸乙酯萃取物。

表1 益母草不同萃取部位的活性跟蹤Table 1 Bioassay of different extraction parts of Leonurus artemisia (Laur.)S.Y.Hu F

乙酸乙酯萃取部位經硅膠柱色譜分離，得到六個組分(Fr.A、Fr.B、Fr.C、Fr.D、Fr.E、Fr.F)，采用改良羅氏培養基進行活性跟蹤，確定Fr.C為活性部位(表2)，其抑制結核桿菌的MIC值為0.4 mg/mL。

表2 益母草乙酸乙酯部位的活性跟蹤Table 2 Bioassay of ethyl acetate fraction in Leonurus artemisia (Laur.)S.Y.Hu F

Fr.C進一步進行硅膠柱色譜分離得到活性組分Fr.2，Fr.2再經硅膠柱色譜反復純化，得到活性單體化合物1，經改良羅氏培養基進行活性測試，化合物1的MIC值為80 μg/mL。

2.2 結構鑒定

化合物1白色針晶(MeOH)；mp.195～196 ℃。1H NMR (400 MHz，CD3OD ) δ (ppm)：7.26 (s,2H),5.07 (s,2H),4.33 (t,J=12 Hz,4 Hz,2H),3.83 (s,6H),3.49 (s,1H),3.38 (dt,J=6 Hz,4 Hz,2H),3.31 (p,J=4 Hz,2H),3.29 (s,1H),3.27 (s,1H),1.86 (m,2H),1.76 (m,2H)。ESI-MS：m/z312 [M+H]+。經薄層層析，用改良的碘化鉍鉀顯色呈磚紅色。與益母草堿對照品經TLC檢測，其Rf值一致，氫譜、質譜數據與文獻[16]對照基本一致，確定化合物1為益母草堿(圖3)。

圖3 益母草堿結構式Fig.3 Structural formula of leonurine

3 討論

益母草常用于月經不調，痛經閉經，惡露不盡，瘡瘍腫毒等癥，是婦科疾病的常用藥。益母草的化學成分主要有生物堿(益母草堿、水蘇堿、益母草啶、益母草寧)、黃酮類、二萜類、環形多肽、阿魏酸等小分子化合物[17]。益母草堿的藥理作用較多，具有舒張冠脈、抑制ATP的合成、抑制炎癥因子的信號通路、抑制糖異生、促進子宮收縮等作用[18]。目前未見益母草堿抗結核桿菌活性的報道。

從結構上看，益母草堿(3，5-二甲氧基-4-羥基-苯甲酸 (4-胍基)-1-丁酯)屬于有機胺類生物堿，含有三個N原子，與一線抗結核藥物異煙肼類似，異煙肼同樣含有3個N原子，一個N組成吡啶環，另外兩個N原子形成肼基，而在益母草堿中，三個N原子以胍基的形式存在，由此我們推測，益母草堿抗結核桿菌機制可能與異煙肼類似。

在我們的初步試驗(尚未報道)中發現，益母草堿在大鼠子宮及其附件中的分布大于異煙肼，這一結果有待擴大樣本量進一步證實。同時我們擬對益母草堿進行結構修飾，提高其抗結核桿菌活性并增加其在子宮中的分布，為治療子宮結核提供新的線索。