芋螺毒素ImI的化學合成及其殺蟲活性研究

吳小英，安婷婷，高炳淼

1海南省人民醫(yī)院；2海南省藥物研究所，海口 570311；3海南醫(yī)學院，海口 571199

芋螺(Cone Snail)主要生長于熱帶海域，屬于軟體動物門，腹足綱，芋螺科，是在沿海珊瑚礁、沙灘上生活的美麗的螺類[1]。芋螺毒素(conotoxins)是來源于芋螺毒管中用于捕獵的一類多肽的集合，其具有豐度高、分子量小、結構多樣、靶點廣泛、特異性強等特點，已經逐漸成為國內外極受關注的新興研究熱點[2,3]。全世界約有500種以上芋螺，根據芋螺食性可分為三大類：食蟲芋螺(大于350種)，食螺芋螺(約70種)，食魚芋螺(約70種)[4,5]。我國芋螺約有80余種，主要分布在海南省管轄的西沙群島、南沙群島和中沙群島，以及臺灣島等熱帶海區(qū)[6]。至今，已從數(shù)百種芋螺中分離到了上千種芋螺毒素，其在鎮(zhèn)痛、癲癇治療、癌癥、戒煙戒毒、疾病診斷和受體研究中具有廣泛的應用價值[7]。部分芋螺毒素已進入臨床研究或已被FDA正式批準為治療新藥，用作特異診斷試劑和鎮(zhèn)痛藥[8]。如由Olivera等從幻芋螺(Conus magus)中分離的ω-MVIIA，已被美國FAD正式批準為治療頑痛的藥物，其商品名為Ziconotide[9]。

隨著化學殺蟲劑的普遍使用，農業(yè)害蟲的耐藥性不斷增加，導致殺蟲劑毒性和使用量都越來越大，生態(tài)環(huán)境受到巨大傷害，進而嚴重威脅著人類健康，由此對新型、高效、安全生物殺蟲劑的需求非常迫切[10,11]。食蟲芋螺毒素能夠特異性作用于昆蟲而具有較強的殺蟲能力，對哺乳動物的毒性很小或無毒副作用，而食蟲芋螺毒素的殺蟲活性和作用靶點尚未展開系統(tǒng)研究[12]。因此，開展食蟲芋螺毒素的研究，篩選獲得高效殺蟲芋螺毒素，為解決化學農藥造成的生態(tài)環(huán)境問題提供一條新途徑。本研究化學合成了芋螺毒素線性肽ImI，經兩步氧化法后質譜鑒定獲得氧化折疊肽ImI，采用MTT法和昆蟲注射法測試其殺蟲活性，可為研發(fā)新型、高效、安全生物殺蟲劑奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

多肽合成相關氨基酸活化試劑(ABI，美國)；色譜級三氟乙酸(Trifluoroacetic acid，TFA )和色譜級乙腈(Acetonitrile，ACN)，購自Thermo Fisher Scientific公司；Vydac分析型C18柱(5 μm，4.6 mm × 250 mm)及制備型C18柱(10 μm，22 mm×250 mm)，購于上海申越實驗器材有限公司。其他常用生化試劑均為國產分析純，購自廣州化學試劑廠。

1.2 實驗儀器

多肽合成儀(ABI 433，美國)；高效液相色譜儀(Waters2535，美國)；電噴霧電離質譜(島津，日本)；冷凍干燥機(Christ，德國)。

1.3 實驗方法

1.3.1 線性肽的合成

芋螺毒素ImI線性肽(GCCSDPRCAWRC-NH2)的合成參照文獻[12]的方法，采用Fmoc化學方法合成ImI的線性肽，樹脂為Wang Resin，從C端至N端合成，HBTU/HOBt/DIEA縮合形成肽鍵。合成過程中非半胱氨酸的側鏈保護基團如下所示：Ser(tBu)，Asp(OtBu)，Arg(Pbf)，Trp(Boc)。半胱氨酸Cys 1和Cys 3用S-Trityl(Trt)保護基團，Cys 2和Cys 4用S-acetamidomethyl(Acm)保護基團。樹脂肽合成后，按照每20 mg的樹脂肽1mL試劑K(82.5% TFA/5% phenol/5% H2O/5% Thioanisole/2.5% EDT，v/v)切割(室溫2 h)，過濾并用20倍體積的-20 ℃冰乙醚沉淀和洗滌回收線性肽粗品，進行HPLC純化，采用Vydac C18柱：流動相A(水，0.1%TFA)，流動相B(乙腈，0.1%TFA)；流速12 mL/min；60 min線性梯度洗脫，B相20%至80%，檢測波長214 nm。經過HPLC反復純化后獲得線性肽，分析型HPLC分析其純度達95%以上，通過質譜鑒定無誤后，進行凍干保存，用于后續(xù)的氧化折疊反應。

1.3.2 兩步法氧化折疊

第一步氧化，將純化后線性肽溶于鐵氰化鉀反應液(K3[Fe(CN)6]10 mmol/L，Tris 0.1 mol/L，pH 7.5)中促使形成第一對二硫鍵(Cys1和Cys3)，線性肽濃度不高于50 mg/mL，室溫氧化折疊45 min。HPLC純化反應后的產物，并進行質譜鑒定。第二步氧化，將純化的產物加入充入氮氣保護的碘(I2)反應液中(7.5 mmol/L I2溶液;水/TFA/乙腈=73∶3∶24，V/V)，反應5～10 min，加抗壞血酸至溶液顏色消失，形成第二對二硫鍵(Cys2和Cys4)得到ImI最終活性產物。采用HPLC對合成的產物純化并進行質譜確認。

1.3.3 MTT法

取對數(shù)期生長的Sf9細胞，用細胞計數(shù)板計數(shù)，按每孔100 μL接種于96 孔板中，每孔細胞數(shù)量控制在103個左右，27 ℃培養(yǎng)至細胞完全貼壁后，分別加入不同濃度的芋螺毒素純品，每組各設置3個復孔，以不加抑制劑的實驗組作對照。27 ℃條件下培養(yǎng)48 h后，每孔加入濃度為5 mg /mL的MTT(3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽)10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。棄去板中培養(yǎng)液及MTT，每孔加入100 μL DMSO(二甲基亞砜)，室溫低速震蕩15 min。待結晶物完全溶解后，在酶標免疫測定儀測定490 nm處的吸光度值。

1.3.4 昆蟲注射法

選用3齡或4齡的黃粉蟲(約180 mg/條)，注射前采用雞飼料正常喂食。在實驗當天將芋螺毒素溶解在0.7%鹽水中至所需濃度，使用微注射器(氣相尖頭微量進樣器，10 μL，上海高鴿)進行注射，注射體積為5 μL，用10 μL 0.7%鹽水沖洗導管死腔中殘留藥物。將溶解的芋螺毒素分別以不同濃度注射到黃粉蟲體內(n=10)。用0.7%鹽水溶液注射對照組黃粉蟲(n=10)，每個濃度做三次重復。在48小時觀察注射芋螺毒素或0.7%鹽水的黃粉蟲死亡情況。

1.3.5 數(shù)據處理

數(shù)據處理和分析采用統(tǒng)計軟件GraphPad Prism6，數(shù)據以mean±SD表示，兩組間數(shù)據分析比較采用t檢驗。*表示差異顯著(P<0.05)，**表示差異極顯著(P<0.01)。

2 結果

2.1 線性肽的合成

采用化學方法合成了ImI線性肽，對粗肽進行HPLC純化(見圖 1)。ImI線性肽的洗脫時間為 9.653 min，最終得到純度為95%的線性肽約20.2 mg。

圖1 HPLC純化線性肽ImIFig.1 HPLC Purification of linear peptide ImI

2.2 氧化折疊

利用鐵氰化鉀溶液和I2溶液對合成的線性肽ImI進行兩步法氧化折疊，并對氧化折疊終產物進行HPLC純化和質譜鑒定。樹脂切割后的線性肽分子量為1497.78 Da，符合含有Acm保護基團的ImI分子量。經第一步氧化后的分子量為1495.78 Da，與氧化前相比少了2 Da，證明第一對二硫鍵形成。第二步氧化折疊后質譜鑒定ImI分子量為1351.58 Da，與第一步氧化后的分子量相差144.2 Da，證明第二步氧化折疊是切割兩個Acm保護基團并形成了第二對二硫鍵(如圖2)。再與其線性肽的分子量1355.634 Da 相差約4 Da，亦證明脫去4個氫原子形成了兩對二硫鍵。通過兩步氧化法最終從20.2 mg線性肽ImI中獲得活性產物約9.75 mg，產率為48.3%。

圖2 氧化折疊后ImI的質譜鑒定Fig.2 Identification of oxidative folding ImI by mass spectrometry

2.3 MTT法

通過MTT法測試芋螺毒素ImI對昆蟲細胞sf9的抑制作用。實驗結果(圖3)表明，與對照組(0.7% NaCl溶液)相比，實驗組均具有顯著性差異。芋螺毒素ImI對昆蟲細胞sf9的抑制效果具有劑量效應，半數(shù)有效量為 0.13 nM。

2.4 昆蟲注射法

不同濃度的芋螺毒素ImI被注射到黃粉蟲的腹部來評價其殺蟲作用。圖4可以看出空白對照和陰性對照組致死率均為0，表明注射法模型對于評價殺蟲作用是可行的。隨著芋螺毒素ImI的注射量的增加，對昆蟲的致死率從16.6%到66.7%，經計算黃粉蟲的半數(shù)致死劑量為0.11 μg/mg。

圖3 芋螺毒素ImI對昆蟲細胞sf9的抑制作用Fig.3 Inhibitory effects of conotoxin ImI on growth of insect sf9 cells注：測試組對比于陰性對照組，*表示具有顯著性差異(*P < 0.05,**P < 0.01)。Note:Compared with the negative control group,the test group showed significant difference(*P < 0.05,**P < 0.01).

圖4 芋螺毒素ImI對黃粉蟲的殺蟲作用Fig.4 Insecticidal effects of conotoxin ImI注：測試組對比于陰性對照組，*表示具有顯著性差異(** P < 0.01,***P< 0.001,**** P <0.0001)。Note:the test group was compared with the negative control group and * indicated significant difference(**P < 0.01,*** P<0.001,****P< 0.0001).

3 討論

隨著化學殺蟲劑的普遍使用，農業(yè)害蟲的耐藥性不斷增加，導致殺蟲劑毒性和使用量都越來越大，食品安全和環(huán)境生態(tài)問題頻現(xiàn)，進而嚴重威脅著人類健康[13]。雖然采取了禁用高毒農藥等措施，但也將出現(xiàn)可替代新農藥品種缺乏等諸多問題。因此，對新型、高效、安全的生物殺蟲劑的需求非常迫切。

乙酰膽堿受體(nAChR)是脊椎動物和無脊椎動物神經系統(tǒng)中快速介導膽堿能突觸傳遞的配基門控離子通道[14]。在昆蟲中，nAChR在神經肌肉接頭處沒有分布，卻是中樞神經系統(tǒng)中最豐富的神經遞質受體，因此成為殺蟲劑的作用靶標[15]。John Moon等采用注射法將重組肽Tgu6.1注射到多毛蟲中樞神經索部位，來鑒定殺蟲活性[16]。Monica Mejia等[17]開發(fā)一種使用果蠅注射和電生理記錄的篩選芋螺毒素的新方法。芋螺毒素ImI是來源于食蟲帝王芋螺(Conusimperialis)，具有4個半胱氨酸形成2個二硫鍵，其作用靶點為α7-nAChR，我們推測其具有殺蟲活性[18,19]。采用化學方法合成芋螺毒素線性肽，經氧化折疊后質譜鑒定獲得芋螺毒素ImI，采用MTT法和昆蟲注射法研究其殺蟲活性。實驗結果表明芋螺毒素ImI具有抑制昆蟲細胞sf9生長的活性，半數(shù)有效量為0.13 nM；對黃粉蟲具有殺蟲活性，半數(shù)致死劑量為0.11 μg/mg。

目前認為多肽類毒素發(fā)揮殺蟲作用的第一作用靶標為nAChR，但沒有發(fā)現(xiàn)其具體作用位點。近年來，對果蠅、桃蚜、煙草天蛾等昆蟲的nAChR進行了分子克隆和功能鑒定，為殺蟲劑作用機理及抗性機制的研究提供分子基礎[20]。多肽類毒素類殺蟲劑作用于昆蟲神經傳導的突觸部位，與乙酰膽堿競爭受體位點，占領受體位點后，抑制神經興奮的傳導，造成昆蟲麻痹，最終死亡[21]。因此，以nAChR作為靶標來研發(fā)新型殺蟲劑需要加以重視，搞清楚芋螺毒素如何特異性作用于昆蟲nAChR各種亞基的作用位點，從本質上揭示其殺蟲作用機制，以進行殺蟲劑的合理設計和高通量篩選，創(chuàng)制出新型生物殺蟲劑，提高其在害蟲防治中的應用價值將是進一步需要開展的工作。