明永冰川低溫細菌分離鑒定及生物學特性

趙曉曼， 周長濤， 魏云林， 季秀玲

（昆明理工大學 生命科學與技術學院，云南 昆明 650500）

地球表面生物圈中超過80%的區域溫度均低于5℃，海洋的大部分區域其水溫低于5℃[1]；而在南北兩極平均溫度僅為-1.8℃ ，絕大多數土壤的溫度即使在夏季也不會超過10℃[2]。這些低溫環境中生存著大量低溫微生物，冷適應細菌在低溫條件下的生存能力使得它們在生態學方面比嗜溫菌更有優勢[3]，冰川被認為是研究宇宙生命進化和地球環境演化等重大問題的“活化石”，同時也是一個多元化和動態的微生物“儲藏庫”。國內外冰川細菌研究方向主要為：新種的發現[4]、適冷機制[5]、固氮機制[6]和冰川細菌相關產物如抗凍蛋白、低溫酶等[7]。可以說冰川微生物的研究只處于起始階段，還有很長的路要走。然而據2010年世界冰川監測機構關于冰川融化的最新評估顯示，冰川消融速度是2000年的2倍，冰川中獨特而稀有的微生物菌種可能在未被人類初識前就因冰川消融瀕危[8]。本研究對明永冰川低溫微生物多樣性的初步研究獲得了一批重要的菌種資源，為尋找有應用價值的產低溫酶菌株、了解該地區低溫微生物多樣性奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 培養基

LB固體培養基（g/L）：胰蛋白胨 10，酵母粉 5，NaCl 10，瓊脂 20；pH 7.2。

LB液體培養基（g/L）：胰蛋白胨 10，酵母粉 5，NaCl 10；pH 7.2。

營養肉汁瓊脂（g/L）：蛋白胨 5，牛肉膏 1，NaCl 5，瓊脂 15；pH 7.0~7.2。

基礎培養基（g/L）：葡萄糖 5，（NH4）SO42，檸檬酸鈉 1，K2HPO4·3H2O 14，KH2PO46， 瓊脂 20；pH 7.0。

1.2 樣品采集和低溫細菌的分離及形態學特征觀察

1.2.1 樣品采集和低溫細菌的篩選與分離 本研究樣品采樣點位于云南省明永冰川 （N28°27′，E98°48′）。在實驗室準備好固體培養基帶到明永冰川。在明永冰川的冰舌地區采集冰、冰川退卻地區土壤、融冰水、冰片和少量土壤塵埃混合樣，共15份樣品，每個平板均勻的鋪灑約0.1 g樣品后立即用封口膜密封。所有的樣品在被運回實驗室之前都置于4~8℃保存。回到實驗室后，土樣用土壤懸浮涂布法篩選分離：稱取少量土樣于滅菌三角瓶中，加入約100倍于土樣質量的無菌水，取土壤稀釋液涂布LB平板。水樣、冰樣直接平板劃線，后均置于13℃培養一周，培養物經過三次劃線分離純化，并觀察菌落形態。

1.2.2 運動性觀察 在潔凈載玻片上加一滴無菌水，挑取一環菌液與水混合，再加一環0.01%的美藍水溶液與其混合均勻。用鑷子取一潔凈蓋玻片，使其一邊與菌液邊緣接觸，然后將蓋玻片慢慢放下蓋在菌液上，在顯微鏡下觀察，發現兩個細菌之間出現明顯的位移的為陽性，否則為陰性。

1.3 菌株的生理生化特性研究

1.3.1 菌株生長溫度范圍 22株菌株使用4、15、25、37℃四個溫度梯度，培養48 h后以未接種的新鮮培養基做陰性對照，然后測光吸收度OD600，重復3次。

1.3.2 抗生素抗性實驗 接種10 μL新鮮培養的菌液于含不同質量濃度 （氨芐青霉素50 μg/mL；卡那霉素50 μg/mL；慶大霉素 7 μg/mL；四環素10 μg/mL）抗生素的5 mL LB液體培養基中，pH 7.0，于13℃、150 r/min培養36 h，觀察菌株對抗生素的抗性。

1.3.3 對不同底物的分解能力 挑取單菌落接種于選擇性橄欖油，干酪素和淀粉培養基上，于15℃培養48 h后觀察降解情況。

1.3.4 氧化酶實驗 用濾紙沾取菌落，滴一滴1%的對氨基二甲基苯胺鹽酸鹽，呈粉紅色，再滴加一滴5%的α-奈酚溶液，若在30 s變成藍色，為陽性反應，若在2 min內不變藍色，則為陰性反應。

1.4 16S rRNA的PCR擴增

利用16S rRNA基因的一對通用引物進行PCR擴增。 引物：F 5′-AGAGTTTGATCCTGGTCAG-3′和R 5′-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′由英俊生物技術有限公司合成。PCR 反應體系（50 μL）：10×Ex-Taq buffer 5 μL ，2.5 mmol/l dNTP 3 μL， 模板 10 ng， 正向引物各 50 pmol，Ex-Taq DNA polymerase 0.2 μL，無菌水補足至 50 μL。 PCR 擴增程序：94 ℃變性 30 s，50 ℃退火 1 min，72 ℃延伸 90 s，30個循環；72℃延伸10 min。

1.5 DNA序列測定和系統發育樹的構建

DNA產物純化后，與pMD19-T載體（Takara）16℃連接過夜，取10 μL連接產物轉化感受態細胞DH5α。 以 M13（RV/M4）為引物（北京三博遠志公司合成）檢測轉化產物。PCR擴增驗證的產物由北京三博遠志公司測序部進行雙向測序，然后將所測序列提交 GenBank，通過 Blast（Ver2.2.14）進行序列同源性檢索分析。選取同源性比較高的典型菌株的16S rRNA基因序列作為參比對象，然后用CLUSTAL X軟件[9]進行多序列比對并計算供試菌株與參比菌株之間的序列相似性，采用鄰位相接法 （Neighbor-Joining），應用MEGA 6.1軟件構建系統進化樹[9]。

2 結果與討論

2.1 細菌分離純化結果

作者分離純化到500多株細菌，通過菌形態、顏色等選出22株細菌做進一步的研究，22株細菌編號、菌落及菌體形態特征見表1。

表1 菌株編號、菌落及菌體形態特征Table 1 Strains number，colony and cell morphology characteristics

2.2 菌株生理生化特性

22珠菌在4、15、25℃幾乎均能生長，37℃時僅一株菌能生長，判定菌株MY14011屬于嗜冷菌，其余21株菌屬于耐冷菌；所有菌株均有氨芐青霉素抗性，對卡那霉素和四環素敏感，部分對慶大霉素敏感；22株菌均無淀粉酶和脂肪酶活性，多數菌株有蛋白酶水解活性；大部分菌株氧化酶反應呈陽性，見表2。

表2 22株細菌生理生化特性Table 2 Physiological and biochemical properties of 22 strains

2.3 分子鑒定結果

分離菌株PCR擴增出的16S rDNA片斷條帶單一，大小約為1 500 bp，連接pMD19-T載體，測序后提交 NCBI，通過 Blast（Ver2.2.14）比對進行分離菌株的初步鑒定。將所得菌株序列與GenBank中相關序列進行同源性檢索分析，并選取同源性高的菌株利用ClustX和Mega軟件構建系統發育樹，見圖1。

圖1 22株菌與相關菌株的系統發育樹Fig.1 Phylogenetic tree of the 22 strains and their relatives

22株菌在進化樹上分布在四個簇群中，其中菌株MY14011與Chromobacterium fluciative的同源性最高；菌株MY0504與Flavobacterium屬的親緣關系最近；菌株MY14015和MY1413與Arthrobacter屬劃分在同一簇群中；其余的18株菌株均歸屬于Pseudomonas屬。

作者采用傳統的微生物分離純化法從明永冰川冰舌地區分離純化獲得22株可培細菌。根據16S rRNA基因序列分析、系統進化分析和部分生理生化特性結果表明：菌株MY0504與Flavobacterium pectinovorumDSM6368（AM230490）親緣關系最近（97.6%），具有蛋白酶活性和氨芐抗性；菌株MY1413和 MY14015分別與Arthrobacter psychrophenolicusDSM1545T （AJ616763） 和Arthrobacter parietesLMG22281T（AJ639830）有很近的親緣關系（98%），具有氨芐抗性；MY14011歸屬于色桿菌屬，與河流色桿菌Chromobacterium fluviatile進化關系最近（97%），具有蛋白酶活性和氨芐抗性，可能為潛在新種，但需要進一步做分子雜交實驗驗證；其余18株菌均鑒定為假單胞菌屬的菌株。

低溫環境中細菌是數量和種類最多，目前從低溫環境中分離得的微生物大多為耐冷菌，嗜冷菌所占比例較小，其中屬于革蘭氏陰性的Pseudomonas屬和革蘭氏陽性的Bacillus屬較多[10]。和天山一號冰川類似[11]，在分離的22株菌種明永冰川假單胞菌屬 （Pseudomonas）屬于的優勢菌株。黃桿菌屬（Flavobacterium）廣泛分布于土壤、淡水、海洋和極地環境中[12]，因其生長環境多樣，具較高的蛋白酶活性，將為商品蛋白酶的開發利用提供有力的菌種資源庫[7]。從2003年到2013年，周培謹和周宇光團隊在中國1號冰川和海螺溝冰川分離出了Flavobacterium屬的7個新種[13]。外籍華人Dechao Zhang從中國一號冰川分離到的Flavobacterium屬的一個新種[14]。作者也從明永冰川分離到一株黃桿菌屬（Flavobacterium）的菌株MY0504。迄今尚沒有在冰川地區分離到Chromobacterium的相關報道，分析原因可能是，河流色桿菌是一種在亞熱帶和熱帶地區的水與土壤中存在的革蘭氏陰性桿菌，明永冰川獨特的低緯度熱帶季風氣候和靠降水而生存的特點，使得能在冰川中分離到Chromobacterium屬細菌，這為進一步研究冰川這一特殊區域的微生物與氣候環境變化的關系提供了方向。

3 結語

研究明永冰川這一特殊生態環境下的低溫微生物多樣性，不僅有助于了解這一特殊地理條件及生態環境下的微生物群落演替規律，而且也對了解微生物―植被―土壤這一系統對全球氣候變化的影響有極其重要的理論意義[15]。當下酶制劑產業發展前景廣闊，對低溫酶的開發和利用具有潛在的經濟價值[16]。