樺褐孔菌提取物抗乳腺癌活性部位篩選及成分分析

劉 鑫， 侯若琳， 許凱強， 李佳歡， 林文雄， 鄭明鋒， 傅俊生*

（1．福建農林大學 食品科學學院，福建 福州 350002；2．福建農林大學 生命科學學院，福建 福州 350002）

樺褐孔菌Inonotus obliquus屬于擔子菌門纖孔菌屬Inonotus[1]，是一種寄生在白樺、榆樹、銀樺等樹種上的白腐菌[2]。其主要分布于俄羅斯北部、北歐、日本北海道以及我國長白山和大興安嶺等北緯40~50°的地區[3]。它是一種藥用真菌，廣泛用于預防和治療肝病、糖尿病、心臟病、胃病等疾病，且無明顯的毒副作用[4]。隨著國內外對樺褐孔菌的深入研究，發現樺褐孔菌提取物具有多種生物活性，主要有抗癌[5-7]、抗氧化[8-9]、增強免疫力[10-11]、降血糖[12]、抗病毒[13]和抗炎[14]，尤其是抗腫瘤方面表現出良好的活性。王文娟[15]等研究發現，樺褐孔菌水提醇沉物對人肝癌細胞的增殖抑制作用優于其他萃取物；Zhao[16]等研究發現，樺褐孔菌對宮頸癌HeLa細胞有明顯的抑制增殖和誘導凋亡作用。

為了進一步尋找樺褐孔菌抗乳腺癌的活性部位，作者選取具有高轉移能力的惡性乳腺癌MDAMB-231作為細胞模型，研究了樺褐孔菌提取物不同溶劑萃取部位抗乳腺癌活性，并采用LC-MS/MS初步分析其主要活性部位的化學成分，為開發利用樺褐孔菌食藥用資源提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人乳腺癌MDA-MB-231細胞：賽百慷生物技術股份有限公司；樺褐孔菌子實體：長白山保護開發區福生園參茸有限公司；石油醚、乙醇、乙酸乙酯、二甲基亞砜（DMSO）、正丁醇：國藥集團化學試劑有限公司；胎牛血清（FBS）：杭州四季青生物工程有限公司；MTT：Sigma公司；RPMI-1640培養基：Gibco公司；其余試劑為分析純。

1.2 儀器與設備

KH3200B型超聲波清洗器：昆山禾創超聲儀器有限公司；高速萬能粉碎機：天津市泰斯特儀器有限公司；N-1000 v-W型旋轉蒸發儀：瑞士Büchi公司；酶標儀：美國Bio-Rad公司；ST16 R型離心機：美國Thermo公司；MCO-15AC型CO2培養箱：日本三洋公司；XDS-3型倒置生物顯微鏡：意大利Optika公司；LTQ XL型 LC-MS/MS：美國 Thermo公司。

1.3 方法

1.3.1 提取與分離方法 樺褐孔菌干子實體置于烘箱干燥至恒質量，用粉碎機粉碎后過60目鐵篩，得干粉。取20 g上述所得干粉于500 mL燒杯中，加入75%乙醇400 mL，70℃超聲60 min，重復提取操作一次，合并提取液，抽濾，收集濾液，倒掉濾渣。減壓濃縮濾液，旋轉蒸瓶每次加液約瓶體積的1/3，壓強0.09 MPa，溫度37℃，回收乙醇得浸膏，浸膏質量4.8 g。以適量水重懸上述浸膏，浸膏依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取4次，合并萃取液并減壓濃縮干燥，得石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位和水部位，操作流程見圖1。以上4種干膏用DMSO促溶，DMSO體積分數小于0.1%。PBS配制成100 mg/mL的儲存液，保存在4℃冰箱，避光保存，使用時配制成所需質量濃度。

1.3.2 細胞培養 MDA-MB-231細胞用含10%FBS的RPMI-1640培養液傳代，在5%CO2、37℃條件下培養，實驗用細胞均處于對數生長期。

1.3.3 MTT法[17]檢測不同萃取部位抗乳腺癌活性將MDA-MB-231細胞的濃度調整到1×105個/mL接種于96孔板，每孔加細胞懸液200 μL，在37℃、5%CO2環境下培養24 h，待細胞貼壁，吸棄培養液，每孔加入180 μL新培養基，將其分成空白對照組（0 μg/mL）和給藥組，每組平行設 4個重復；空白對照組加入20 μL不含藥物的培養基，給藥組依次加入樺褐孔菌提取物不同萃取部位藥液20 μL，使其終質量濃度分別為 10、20、30、40、50、60、80、100 μg/mL，繼續培養24 h后，吸除藥液，每孔加5 mg/mL 的 MTT 20 μL，培養基 180 μL，培養 4 h 后，吸除 MTT，每孔加 150 μL DMSO， 振蕩 15 min，570 nm下測光密度OD值。計算藥物對腫瘤細胞的抑制率，對藥效進行初步評價，并采用lgC-抑制率回歸分析法計算半數抑制濃度（IC50）。

圖1 實驗操作流程Fig.1 Operation process of the experiment

1.3.4 活性部位對MDA-MB-231細胞生長的影響將MDA-MB-231細胞的濃度調整到1×105個/mL，接種于6孔板，每孔加2 mL細胞懸液，培養24 h，待細胞貼壁，吸棄培養液，加入藥物（活性最強萃取部位）質量濃度為分別為20、40、80 μg/mL的細胞培養液2 mL，同時設置空白對照組 （0 μg/mL），于37℃培養箱中培養，在24 h時觀察并記錄細胞形態。

1.3.5 劃痕試驗[18]檢測活性部位對MDA-MB-231細胞遷移力的影響 將MDA-MB-231細胞接種于6孔板內培養，待細胞基本長滿，用200 μL槍頭于細胞層中縱向劃痕，造成培養細胞缺損區域帶，加入一定濃度的含藥（活性最強萃取部位）無血清培養基繼續培養48 h，倒置顯微鏡下觀察劃痕處細胞的覆蓋情況。

1.3.6 LC-M/MS初步分析 LC參數設定：色譜柱：Hypersil GOLD C18，100 mm×2.1 mm，5 μm；流動相：A：ACN B：0.1%甲酸水溶液； 流速：300 μL/min；進樣量：10 μL；洗脫程序見表 1。

表1 LC梯度洗脫程序Table 1 LC gradient elution program

質譜參數設定見表2。

表2 質譜參數Table 2 MS parameters

1.3.7 統計學處理 數據用SPSS 13.0統計軟件分析處理。統計描述：計量資料數據用x±s表示。兩組間的均數比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 MTT法檢測樺褐孔菌提取物各萃取部位抗乳腺癌活性

結果見表3和圖2。藥物作用24 h后，在一定質量濃度范圍內，各萃取部位均可抑制乳腺癌MDA-MB-231細胞增殖，且呈一定的劑量依賴性；根據IC50的數據顯示，藥物對MDA-MB-231細胞的抑制作用大小依次為：石油醚部位>正丁醇部位>水部位>乙酸乙酯部位；其中乙酸乙酯部位在低質量濃度下對細胞的增殖有促進作用，隨著質量濃度進一步的增大，則表現出抑制作用；石油醚萃取部位的抑制強度最大，其作用24 h的IC50值為76.17 μg/mL，因此選石油醚部位進行后續試驗。

表3 MTT法檢測樺褐孔菌提取物各萃取部位抗乳腺癌MDA-MB-231細胞活性（%，x±s，n=4）Table 3 Anti-breast cancer（MDA-MB-231） activity of different extraction parts

2.2 樺褐孔菌提取物石油醚部位對MDA-MB-231細胞生長的影響

上述結果顯示，石油醚萃取部位相比其它萃取部位對腫瘤細胞表現出更強的抑制作用，因此選取該部位進一步探究其對細胞生長的影響。

形態觀察結果見圖3。由形態觀察可知：空白對照組MDA-MB-231細胞生長正常，加藥組隨著石油醚部位藥物的質量濃度升高，細胞形態發生明顯的變化，細胞逐漸由梭形變成圓球形，并逐漸脫落，貼壁細胞數量減少，排列疏松，形態學上呈細胞凋亡狀態[19]。

2.3 劃痕試驗檢測樺褐孔菌提取物石油醚部位對MDA-MB-231細胞遷移的影響

劃痕實驗結果見圖4。48 h時空白對照組劃痕區變窄；加藥組劃痕區細胞的遷移速度減慢甚至停滯、細胞脫落。可見樺褐孔菌提取物石油醚萃取部位對MDA-MB-231細胞的遷移存在一定的抑制作用。

圖3 不同質量濃度的藥物對MDA-MB-231細胞凋亡的影響Fig.3 Effect of different concentration on the growth of MDA-MB-231 cells

圖4 樺褐孔菌石油醚部位對細胞遷移的影響Fig.4 Effect of petroleum ether extract fractions on cell migration

2.4 LC-MS/MS對石油醚部位中可能存在的物質進行初步分析

為進一步探究石油醚活性部位其可能含有的化學成分，采用LC-MS/MS方法對該部位成分進行初步分析。經LC-MS/MS檢測，樺褐孔菌石油醚萃取物中有14個離子強度較大的色譜峰被檢測到，對這些峰的一級質譜測得精確相對分子質量計算分子式，結合二級質譜的分析以進一步解析該14個色譜峰的結構組成；使用Thermo ScientificTMMass FrontierTM7.0質譜解析軟件對數據進行分析處理，推測對應分子可能的結構，分析數據見表4。

3 結 語

近年來，乳腺癌逐漸成為嚴重威脅人類健康的疾病，抗腫瘤藥物的主要作用之一是有效的抑制腫瘤細胞的生長和增殖。樺褐孔菌作為食藥用菌，具有抗腫瘤等作用，并且毒副作用小，因此研究其抗乳腺癌活性部位及成分為進一步開發利用樺褐孔菌資源具有重要的意義。

表4LC-MS/MS分析數據Table 4LC-MS/MS data

作者采用MTT法檢測樺褐孔菌提取物各萃取部位抗乳腺癌MDA-MB-231細胞活性，結果顯示樺褐孔菌石油醚萃取部位對MDA-MB-231細胞的抑制作用最強，作用24 h的IC50值為76.17 μg/mL，實驗中樺褐孔菌提取物各萃取部位對MBA-MB-231細胞的抑制活性表現為：石油醚萃取部位>正丁醇萃取部位>水萃取部位>乙酸乙酯萃取部位；由細胞形態觀察可知，隨著石油醚部位藥物的質量濃度升高，細胞形態發生明顯的變化，并有誘導細胞凋亡的趨勢；劃痕試驗結果表明樺褐孔菌提取物石油醚萃取部位對MDA-MB-231細胞的遷移存在一定的抑制作用。

實驗運用LC-MS/MS技術，對樺褐孔菌石油醚萃取部位的化學組成進行了初步分析。在負離子模式中有14個離子強度較大的色譜峰下被檢測到，經過Mass FrontierTM7.0軟件解析和相關數據庫的檢索，14個化學成分被初步表征，其中的10種成分被初 步 鑒 定 ， 分 別 為 ：N1-（4-methoxy-1，2，5-thiadiazol-3-yl）sulfanilamide、氟芐煙酸、脯氨酸-苯丙 氨酸 、5，5-二 苯 基 海 因 、N-[p-[[（2-amino-4-hydroxy-6-pteridinyl）methyl]amino]benzoyl]glutamic acid、Pro-Hyp、沒食子酸、金絲桃素、苦杏仁苷、胭脂紅酸，這些化合物均首次從樺褐孔菌中得到鑒定。有研究報道金絲桃素對乳腺癌細胞有一定的抑制活性，而其它初步鑒定的化合物對乳腺癌細胞的抑制活性未見文獻報道，關于何種成分發揮主要的抗乳腺癌活性還有待進一步研究。雖然其中4個物質雖沒有初步鑒定，但亦對它們的相對分子質量及分子式進行了初步的表征。本研究采用的液質聯用方法目的在于快速表征由多組分構成的復雜化學體系，能降低傳統分離純化過程中的盲目性，有利于提高活性化合物發現的概率，為進一步開發和利用樺褐孔菌藥用資源提供科學的依據。