四溴雙酚A對日本虎斑猛水蚤生殖的影響?

王 超， 朱麗巖， 卜亞謙， 董輝輝， 王 騰， 陳 香

(中國海洋大學海洋生命學院，山東 青島 266003)

四溴雙酚A(TBBPA)是產量最高的溴系阻燃劑，約占據了全球阻燃劑市場的60%，被廣泛用于各類型工業品和消費品生產中[1-3]。四溴雙酚A及其衍生物可通過正常的生產、使用和處置等途徑進入環境中[1]。目前在世界各地(包括北極地區[4])的空氣、灰塵、土壤、水、沉積物和生物樣本，甚至是人體組織樣本中均檢測到TBBPA的存在[5]，國際癌癥研究機構已將其劃為2A級可能致癌物[6]。已有研究表明：TBBPA具有生殖毒性，濃度高于1.5 mol/L便能導致斑馬魚早熟卵母細胞增多，產卵率、孵化率和仔魚成活率下降[7]；TBBPA具有甲狀腺干擾效應，能引起大鼠甲狀腺動態失衡對其內分泌產生干擾[8]；TBBPA具有細胞毒性，能干擾哺乳動物細胞信號轉導通路，使細胞存活率顯著降低[9]，甚至能通過誘導組織產生活性氧而引起水生生物的氧化脅迫[10]。此外，TBBPA還具有神經毒性、免疫毒性、雌激素干擾效應等[11]。TBBPA作為一種持久性的環境內分泌干擾物，將會對長期暴露其中的有機體造成不可忽視的危害。

橈足類是海洋浮游動物類群的重要組成部分，對海洋生態系統的物質循環和能量流動起著承上啟下的關鍵作用。橈足類體型小、生活史短、繁殖能力強，是理想的實驗模式生物。其中日本虎斑猛水蚤在我國近海及潮間帶分布廣泛，性別差異明顯，為雜食性動物，且對環境波動耐受性較強，比其他橈足類更易于在實驗室存活，利于進行實驗室馴化培養[12]。

當前的TBBPA毒性研究主要集中于魚類或嚙齒類動物，對橈足類的生殖毒性報道相對較少，因此本研究選取日本虎斑猛水蚤為實驗對象，運用實驗生態學方法、組織切片技術和透射電子顯微鏡技術，觀察了TBBPA暴露下其生殖指標、卵巢組織結構和卵母細胞超微結構的變化，旨在個體、組織和細胞三個層面探討TBBPA對日本虎斑猛水蚤生殖的影響，為進一步了解TBBPA的生殖毒性提供了參考數據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

日本虎斑猛水蚤采自青島匯泉灣附近海域，已在實驗室經馴化培養3 a以上，培養條件：溫度20 ℃、鹽度30、光照12 h (L) : 12 h (D)。海水經 0.45 μm的微孔濾膜過濾并充分曝氣后使用。實驗餌料為5 × 104cells/ml青島大扁藻(Platymonashelgolandica)、5×104cells/ml三角褐指藻(PhaeodactylumtricornutumBohlin)和酵母(Saccharomycescerevisiae；Anqi?，hina)2∶2∶1 的混合液。

TBBPA固體購自J&K化學試劑有限公司，以二甲亞砜(DMSO)作為助溶劑，配制濃度為10 g/L的母液，并用過濾海水將其稀釋至50 mg/L備用。各實驗組中DMSO所占比例均不超過0.005%[13]。

1.2 實驗方法[12-14]

本實驗室的急性毒性實驗測得TBBPA對日本虎斑猛水蚤48h-LC50為4.423 mg/L，急性實驗培養條件同上述馴化培養條件。

實驗設計：根據48h-LC50值，設定4個TBBPA濃度組(分別為55.29、110.58、221.15、442.30 μg/L)和溶劑對照組(DMSO含量與最高濃度組助溶劑含量一致，為44 μL/L)，每實驗組設3個平行。將孵化24 h內的無節幼蟲置于24孔板中，每板為一個平行組，實驗條件同上。待其發育至橈足類幼體挑至6孔板中待雌體抱卵，各平行隨機挑選4只抱卵雌體，進行自首次抱卵時間開始計數10 d內的生殖情況觀察，記錄各項生殖指標。每12 h觀察一次，24 h投餌并換水50%。

組織結構觀察：經TBBPA暴露20 d，在每個濃度組中隨機挑選首次抱卵的正常雌體各5只，于Bouin氏液固定24 h后，常規石蠟包埋，切片厚度5 μm，H-E染色，Olympus BX53型顯微鏡拍照觀察。

超微結構觀察：經TBBPA暴露20 d，在每個濃度組中隨機挑選首次抱卵的正常雌體各5只，于1.5 mL離心管中，立即加入3%戊二醛，4 ℃條件下固定24 h后，用1%鋨酸進行雙重固定，梯度丙酮脫水，Epon812環氧樹脂包埋。包埋后的樣品于LKBV超薄切片機在橈足類體長1/2處切片，醋酸鈾和檸檬酸鉛雙重染色，日立H-700型透射電鏡觀察并拍照。

1.3 數據分析

采用SPSS 17.0對實驗數據進行單因素方差分析(one-way ANOVA)和LSD多重比較分析。

2 實驗結果

2.1 TBBPA對日本虎斑猛水蚤生殖指標的影響

2.1.1 TBBPA暴露下日本虎斑猛水蚤的首次抱卵時間 由圖1知：對照組首次抱卵時間為17.16 d，由低濃度到高濃度，各組抱卵時間分別為17.99、18.28、18.84和19.23 d，與對照組相比，首次抱卵時間均受到一定程度延遲，其中221.15 μg·L-1TBBPA組差異顯著(P<0.05)，442.30 μg·L-1TBBPA組差異極顯著(P<0.01)。與對照相比，各濃度組變態時間均延遲，且442.30 μg·L-1TBBPA組差異顯著(P<0.05)；而各濃度組成熟時間均無顯著差異(P>0.05)。

(N-A：首次抱卵時間；N-C：無節幼蟲至橈足幼體的發育時間；C-A：橈足幼體至成體抱卵的成熟時間。N-A: the first spawning time, N-C: the nauplius phase, C-A: the copepodids phase.Note: *P<0.05 ,**P<0.01. )

圖1 不同濃度TBBPA暴露下日本虎斑猛水蚤的首次抱卵時間
Fig.1 The first spawning time ofT.japonicusexposed to TBBPA

2.1.2 TBBPA暴露下日本虎斑猛水蚤的性別比 對照組日本虎斑猛水蚤性別比(雌/雄)為0.73，雄性個體占優勢，而各TBBPA濃度組性別比分別為0.59、1.32、1.29、1.23。與對照組相比，中高濃組日本虎斑猛水蚤性別比升高，差異顯著(見圖2)。

(* P<0.05 , ** P<0.01)圖2 不同濃度TBBPA暴露下日本虎斑猛水蚤的性別比Fig.2 The sex ratio of T. japonicus exposed to TBBPA

2.1.3 TBBPA暴露下日本虎斑猛水蚤的卵囊發育時間，抱卵次數和產卵量 不同濃度TBBPA暴露下，自日本虎斑猛水蚤首次抱卵時間開始計數10天內，各濃度組抱卵次數和卵囊發育時間，與對照組相比均無統計學上的顯著差異。就生殖力而言，對照組日本虎斑猛水蚤產卵量為74.44 eggs·female-1，而55.29 μg·L-1TBBPA組雌體生殖力顯著升高(P<0.05)，為98.67 eggs·female-1，其余各組生殖力均無顯著性差異(P>0.05)(見表1)。

表1 不同濃度TBBPA暴露下日本虎斑猛水蚤的 卵囊發育時間、抱卵次數及產卵量Table1 The oocyst development time, number of clutches and fecundity of T. japonicus measured over 10 days

Note: *P<0.05.

2.2 TBBPA對日本虎斑猛水蚤卵巢組織結構和卵母細胞超微結構的影響

2.2.1 TBBPA暴露下日本虎斑猛水蚤的卵巢組織結構 對日本虎斑猛水蚤卵巢的組織切片觀察發現：對照組日本虎斑猛水蚤卵巢中，卵母細胞形態完整，細胞排列緊密；細胞質分布均勻；細胞核位于細胞中央，核膜清晰，卵黃合成位點圍繞細胞核分布、清晰可見。與對照相比，各TBBPA組中卵巢組織結構良好，未見顯著異常現象(見圖3)。

2.2.2 TBBPA暴露下日本虎斑猛水蚤卵母細胞的超微結構 日本虎斑猛水蚤卵母細胞超微結構如圖4所示。對照組中，卵母細胞內線粒體和卵黃顆粒結構完整，且數量較多。與對照組相比，55.29 μg·L-1組中，日本虎斑猛水蚤卵母細胞超微結構完整，無顯著差異。110.58 μg·L-1組中，卵母細胞內線粒體和卵黃結構基本完整，較少部分線粒體內嵴斷裂。221.15 μg·L-1組中，線粒體內嵴斷裂溶解增加，個別線粒體囊泡化；少部分卵黃膜溶解、卵黃顆粒皺縮變形。442.30 μg·L-1組中，卵母細胞內囊泡化線粒體比例增加，少數線粒體膜溶解導致線粒體解體；部分卵黃顆粒的卵黃膜溶解，此外卵黃數量較少且多為未發育完全的初級卵黃。

3 討論

3.1 TBBPA對日本虎斑猛水蚤生殖指標的影響

橈足類從無節幼蟲發育至成體首次抱卵的時間段稱為首次抱卵時間。TBBPA暴露條件下，日本虎斑猛水蚤的首次抱卵時間顯著延長，這可能是橈足類個體在應對不良環境時，自身能量收支失衡，用于生長發育的生物能減少造成的。有研究表明，TBBPA會影響橈足類的攝食、耗氧和排氨等生命活動，導致能量收支失衡[13-14]。橈足類雌體在首次抱卵前需經歷變態發育(N-C)和性成熟發育(C-A)兩個階段。Marcial等[15]發現，日本虎斑猛水蚤的變態期和成熟期對雙酚A等雌激素干擾物的影響最敏感。由結果可知，本研究中日本虎斑猛水蚤變態期發育比成熟期發育更容易受到TBBPA影響而顯著延遲。Lee等[16]測定了9種污染物對日本虎斑猛水蚤不同生命指標的影響，亦發現變態時間和成熟時間敏感性較高，且變態時間更為敏感。因此推測，日本虎斑猛水蚤首次抱卵時間的延長，主要是無節幼蟲變態發育期受到脅迫延長，使橈足類個體性成熟同步性降低影響交配所致。

(a. 對照；b.55.29 μg·L-1；c.110.58 μg·L-1；d.221.15 μg·L-1；e.442.30 μg·L-1；oog. 卵原細胞；ooc. 卵母細胞；比例尺=50 μm。 a. control；b.cTBBPA55.29 μg·L-1；c.cTBBPA110.58 μg·L-1；d.cTBBPA221.15 μg·L-1；e.cTBBPA442.30 μg·L-1；oog. Oognium；ooc. Oocyte；Bar =50 μm.)

圖3 不同濃度TBBPA暴露下日本虎斑猛水蚤的卵巢組織結構
Fig.3 The histological structure of ovary inT.japonicusexposed to TBBPA

(a.對照；b.55.29 μg·L-1；c.110.58 μg·L-1；d.221.15 μg·L-1；e. 442.30 μg·L-1；M. 線粒體；Y. 卵黃顆粒；N. 細胞核；比例尺=1 μm。a. control; b.cTBBPA=55.29 μg·L-1; c.cTBBPA=110.58 μg·L-1; d.cTBBPA=221.15 μg·L-1;e.cTBBPA=442.30 μg·L-1; M. Mitochondrion; Y. Yolk granule; N. Nucleus; Bar =1 μm. )

圖4 不同濃度TBBPA暴露下日本 虎斑猛水蚤卵母細胞的超微結構
Fig.4 The oocyte ultrastructure ofT.japonicusexposed to TBBPA

經不同濃度TBBPA暴露后，中高濃度組日本虎斑猛水蚤性別比顯著升高，傾向雌性化。這可能有兩個原因：一方面，大量研究表明暴露于脅迫條件中的橈足類，由于雌體承擔了繁殖后代的責任，其耐受力高于雄性[17-19]。因此，日本虎斑猛水蚤雄性個體可能對TBBPA的毒性更敏感，更容易受到脅迫死亡，死亡率的性別差異導致性別比例失調[19]。另一方面，甲殼動物在孵化期間無法鑒定其幼蟲性別，只有經過幼蟲的連續蛻皮后，性別特征才能發育。Ylenia C等[20]也曾指出，一些哲水蚤種在CⅠ期間就已經出現性腺，但其性別分化直到CⅣ期才開始，且雄性第二特征只受雄性激素的控制[21]，任何干擾雄性激素的因素都能阻礙雄性的分化。TBBPA具有弱的雌激素作用，因此可能在一定程度上擾亂了性別分化。隨著暴露時間的延長，TBBPA終會也對橈足類雌體造成不可逆的傷害，從而不利于種群的發展。

TBBPA作用下，日本虎斑猛水蚤的卵囊發育時間有縮短的趨勢。鞏文靜[13]的研究中也發現，18μg/L濃度的TBBPA便能顯著促進指狀偽鏢水蚤卵囊成熟，縮短卵囊發育時間。Feng G[22]等研究了PCB126對日本虎斑猛水蚤的慢性毒性影響，發現F0代雌體超過12 d的抱卵次數均無顯著差異。本研究中，各濃度組抱卵次數亦無顯著差異。而經TBBPA暴露后，各濃度組日本虎斑猛水蚤的生殖力均不同程度升高，55.29 μg·L-1TBBPA組差異顯著。有研究表明，生物體為了適應逆境，會對能量進行收支權衡[23]，增加生殖量以掩蓋死亡率，維持種群穩定[24]。由此推測，日本虎斑猛水蚤分配了更多的能量用于生殖來抵抗不良環境的脅迫，維持種群穩定，生殖力的升高彌補了發育的延遲。此外，較低濃度污染物可刺激橈足類攝食增加、代謝速度加快[25]，引起產卵率增高[26]，因此低濃度組生殖力顯著升高。目前，TBBPA對橈足類生殖的慢性毒性研究還相對較少，尤其是低劑量長期暴露條件下的影響，可通過多世代暴露研究TBBPA的生殖毒性機制及生物蓄積毒性。

3.2 TBBPA暴露條件下日本虎斑猛水蚤卵巢組織結構的變化

性腺的質量對生物體的繁殖至關重要[27]，然而環境中的多種內分泌干擾物均能對橈足類的卵巢組織造成影響，如甲基睪丸素、來曲唑和氯化三苯基錫均能使湯氏紡錘水蚤的卵巢發生卵黃合成紊亂、卵細胞退化等組織學病變[28]。TBBPA同樣能對動物的性腺造成影響，例如，經TBBPA暴露后斑馬魚卵巢中的卵泡發育受到抑制，精巢損傷嚴重[29]。不同的是，本研究中，各濃度組日本虎斑猛水蚤的卵巢組織結構與對照組相比無顯著差異，這可能是取材時間較早導致。因為用于組織切片的樣本均為首次抱卵24 h內的雌體，該暴露時間或許還不足以使得TBBPA的負面影響在組織層面呈現，但推測日本虎斑猛水蚤卵細胞的超微結構已有顯著變化。另外，楊蘇文等[30]指出相同濃度的TBBPA在組織層次上對鯽魚的卵巢無顯著影響，而雄性個體更容易受到毒害，精巢明顯受損。本研究未對雄性個體的性腺進行組織切片觀察，因此有必要進一步研究相同濃度TBBPA對雄性日本虎斑猛水蚤精巢組織的影響。

3.3 TBBPA暴露條件下日本虎斑猛水蚤卵母細胞超微結構的變化

結果顯示，卵母細胞中出現線粒體和卵黃膜結構的溶解，卵黃顆粒發育滯后等變化，這表明TBBPA能對日本虎斑猛水蚤卵母細胞的超微結構造成損傷，阻礙卵細胞的發育。

對甲殼動物而言，卵母細胞中的線粒體主要功能是維持呼吸代謝，為卵黃發生等生理過程提供所需的能量，還直接參與內源性卵黃的形成[31-32 ]。TBBPA暴露下，部分線粒體膜結構斷裂溶解、出現囊泡化、甚至解體，這可能會阻斷卵母細胞的能量供應，阻礙卵黃發生過程。卵黃顆粒是卵母細胞中營養物質儲備的場所，為胚胎的發育提供物質和能源，其數量、分布及組分等不僅直接影響卵子的成熟和質量，還會對后續胚胎發育造成影響[32-33]。TBBPA暴露下，較高濃度組卵黃顆粒數量略微減少且部分卵黃處于初級階段，這說明TBBPA在一定程度上抑制了卵黃合成，卵黃發育滯后。此外個別卵黃顆粒皺縮變形、卵黃膜溶解，這將直接導致卵黃質量下降，進而阻礙卵母細胞的發育，甚至造成子代胚胎發育滯后或停止。但在卵巢組織和個體生殖層次并未表現出相應的脅迫效應，這可能因為卵母細胞中受損超微結構所占比例相對較小，不足以引起整體的顯著變化。

TBBPA會誘導細胞凋亡的發生[34-37]，日本虎斑猛水蚤卵母細胞內膜結構的溶解，卵黃顆粒畸形等，均是細胞凋亡的表現。研究表明，一方面，TBBPA可通過線粒體去極化及Ca2+信號失調使細胞凋亡[34]，另一方面，脅迫條件可造成橈足類個體氧化損傷，體內的活性氧也可誘導細胞凋亡[31]。因此，研究TBBPA作用下線粒體、Ca2+和活性氧如何協作誘導細胞凋亡，對了解TBBPA的細胞毒性及生殖毒性具有重要意義。

綜上可知，經TBBPA單世代暴露，日本虎斑猛水蚤的個體繁殖指標(首次抱卵時間、性別比和生殖力)和卵母細胞的超微結構均受到了顯著影響，本研究為評估TBBPA對海洋生物的毒性效應提供了基礎數據。為了更全面的了解TBBPA的生殖毒性，需進一步在分子層面研究TBBPA的作用機制。