動脈粥樣硬化動物模型研究進展與中醫病證結合的造模思路探析

林豐夏，李 亮，曾志聰，宋銀枝

動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是冠心病、腦梗死等心腦血管疾病發病基礎，因其有非常高的發病率和死亡率，所以引起廣泛重視[1]。盡管以調脂、抗血小板凝聚等為核心的動脈粥樣硬化疾病的防治手段不斷推進，但AS仍是威脅發達國家與發展中國家人類健康的“罪魁禍首”。近年來中醫藥在動脈粥樣硬化性疾病防治上取得許多可喜成果。辨證論治是中醫學的特色，在AS的中醫診治中具有關鍵性的作用。對于AS的辨證分型存在地域性差異，溫暖潮濕的嶺南地區病人則以濕熱證為主[2]，而寒冷的西北地區病人以陽虛證多見[3]。不同證型的AS，遣方用藥可截然相反。對于中醫藥的研究不能停留在“只見樹木不見森林”的程度，在實驗研究中堅持“整體觀”與“辨證論治”原則，可讓傳統醫學與現代生命科學領域充分接洽。因此完成“濕熱證”與“陽虛證”AS動物模型的建立，在研究AS不同證型的病理特征及驗證中醫辨證論治的思想有重要意義。隨著“濕熱證”與“陽虛證”AS模型的建立，將進一步了解不同證型AS的病理特點。對于濕熱證的AS模型，在其模型上使用小檗堿等清熱祛濕藥物是“正治”，其效果是否較“陽虛證”AS模型好？若在“濕熱證”AS模型使用已證實具有改善AS的辛溫通陽藥物(如蔥白提取物等[4])還能否取得良好效果？這些設想將在“濕熱證”與“陽虛證”AS模型建立的基礎上進一步明確中醫辨證論治的重要性。

鑒于此，本研究通過對既往文獻的檢索、閱讀、理解提煉，加入簡單評述，探討建立動脈粥樣硬化疾病中常見的兩種中醫證型(濕熱證、陽虛證)動物模型的建立方法，為進一步揭示中醫中藥在防治動脈粥樣硬化中的作用機制提供幫助。

1 AS實驗動物選擇

AS是一種慢性的血管病變，建模時間一般較久，故需要選擇與人類的血管解剖特點相似、生命力及抗感染能力較強的實驗動物。常用的動物模型包括大鼠、小鼠、兔、小型豬等。

1.1 大鼠 大鼠容易飼養，生命力頑強，且大鼠為雜食性動物，食性特點與人類相似，手術耐受性好[5]。因此基于大鼠建立AS模型的研究較多，如邢玉桂等[6]利用8周齡的Wistar大鼠，經高脂高糖飲食+維生素D3灌胃8周后，成功制作出動脈粥樣硬化大鼠模型；賴玲等[7]利用健康成年的SD雄性大鼠，高脂飲食+維生素D3+L-甲硫氨酸喂養4周、6周、8周后，SD大鼠分別出現了動脈粥樣硬化早、中、晚期的典型改變。有學者應用高脂飲食配合免疫損傷，比較了HFJ近交系大鼠與Wistar封閉群大鼠在AS模型建立中的優劣，結果發現HFJ大鼠造模成功率優于Wistar大鼠，可作為新一代的AS動物模型[8]。但HFJ大鼠體形及動脈較小，無膽囊，對外源性膽固醇吸收差，具有抗實驗性 AS 特性等不利因素[5]，制約了其進一步發展。

1.2 小鼠 基于小鼠建立的 AS 動物模型的研究最為廣泛，主要是因為小鼠的病變過程與人類相似，另外小鼠價格低廉、飼養成本低、易于繁殖、可進行基因操作的特點也很大程度上促進了小鼠的應用。同時其發病周期相對較短，這有利于觀察與操作[9]。隨著基因工程技術的進步、轉基因與基因敲除等技術的出現，誕生的新型轉基因AS模型小鼠更具有獨特優勢。載脂蛋白E(apolipoprotein E，ApoE)缺陷株(ApoE-/-)小鼠和低密度脂蛋白(low density lipoprotein，LDL)受體缺陷株(LDL-R-/-)小鼠是當前研究、應用最成熟的模型小鼠。ApoE-/-小鼠在正常的飲食情況下也會自發出現動脈粥樣硬化，配合高脂飼養能更快產生易損斑塊或形成血栓，AS模型的成功概率會明顯增加[10]。但ApoE-/-小鼠缺乏在人類AS病變過程中非常重要的LDL，其血漿中的膽固醇主要被脂蛋白殘粒所運載而非LDL，且ApoE蛋白同時還具有影響免疫功能及巨噬細胞、脂肪組織的生理功能，而這些均參與AS形成過程，所以將分析其具體機制[11]。 LDL-R-/-小鼠的優勢在于LDL受體(LDLR)蛋白的缺失主要影響脂蛋白的攝取和清除，較ApoE-/-具有功能單一性，但LDL-R-/-小鼠不采用高脂高糖飲食難以產生滿意的AS模型，造模成功的概率相對較低[12]。總之，轉基因小鼠經過高脂飲食喂養后容易產生AS模型且病變過程與人類相似，近年來已成為AS動物模型制作的主要實驗動物。

1.3 豬 豬不但心臟、血管等結構在解剖和功能，包括血液學特點和血液的生化指標，都與人類極其相似。而且其脂質代謝機制也和人類相仿，其形成AS斑塊的分布、組織結構和發病機制也與人類相近[13]。以往受限于家豬的較大體型、飼養管理與操作困難、維持成本高、研究者不熟悉等缺點，其應用不廣泛。但近年來培育的小型豬相對解決了這些不足，應用小型豬制作動脈粥樣硬化模型的研究越來越多。李艷君等[14]通過高脂、高熱量方法飼養廣西巴馬小型豬半年，發現其主動脈、頸動脈、腹動脈內膜均明顯增厚，內膜下可觀察到少量的泡沫細胞，并且觀察到動脈粥樣硬化指數值達到3.8以上并維持3個月，即可初步認定AS模型建立成功。

1.4 其他AS動物模型 目前報道的文獻，還有利用兔、鴿、猴子、鵪鶉等實驗動物制作AS動物模型。兔對外源性的膽固醇吸收率高，且體內脂質不易清除，采用不同的飼養方法可形成不同的AS類型，且具有大小合適、喂養成本相對可接受等特點，但因為其是食草動物，不能自發形成AS動物模型，免疫力低下，死亡率較高，造模周期長等不足限制了其應用[5]。田卉等[15]利用高脂+煙酰水楊酸75 mg/(kg·d)喂養鵪鶉6周后，高脂喂養的兩組動物血清總膽固醇(total cholesterol，TC)、三酰甘油(triglyceride，TG)、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol，LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(how density lipoprotein cholesterol，HDL-C)升高，動脈斑塊發生率達到100%，但其缺點在于血管特點與人類不相近。猴子經過高脂高膽固醇飼料喂養后，可產生與人類類似的AS病變[16]，但猴子作為靈長類保護動物，價格昂貴，使用受到限制。

2 AS動物模型復制方法

AS相關的研究很多，根據AS不同的發病機制，AS動物模型的制作方法也很多。比如基于脂質浸潤學說，采用高脂高膽固醇喂養的方法被研究者廣泛使用；基于內皮損傷反應學說，采用機械損傷的方法制作AS模型；基于免疫損傷學說，采用免疫損傷法等。各種復制方法均有其優缺點。

2.1 高脂高膽固醇飼喂法 基于脂質浸潤學說，采用高脂飲食的喂養方法，接近人類飲食，制作成功的AS動物模型病變特點近似人類。文依等[17]將膽固醇溶解于乙醇后與普通飼料混勻配成高膽固醇飼料(1.5 g膽固醇配148.5 g普通飼料)，喂養新西蘭兔12周后成功造模；李淑蓮等[18]在普通飼料中添加10 %膽固醇和20 %豬油乳劑，連續喂養日本大耳白兔8周成功造模。但目前在飼料成分種類、配伍比例未達成共識，而且造模時間較長，這均為其缺點。

目前常用混合型飼料的喂養方法，該法克服了單純高脂飲食喂養的動物模型病變血管無鈣質沉積缺陷，并且可以加速AS的形成，縮短試驗周期。賴玲等[7]利用高脂飲食+維生素D3+L-甲硫氨酸喂養健康成年的SD雄性大鼠，其中模型組分為3組，模型一組采用30%蛋黃粉、25%花生、34.3%基礎飼料、0.7%礦物質維生素、10%豬油喂養；模型二組采用3%膽固醇、0.5%膽酸鈉、0.2%丙硫氧嘧啶、5%白糖、10%豬油、81.3%基礎飼料喂養；模型三組采用1%膽固醇、0.4%膽酸、5%豬油、93.6%基礎飼料喂養，在第4周、第6周、第8周測定大鼠血脂，發現模型組大鼠血清 TG、TC 和 LDL與對照組相比均呈現上升趨勢，而高密度脂蛋白(HDL)則呈下降趨勢，高脂飲食+維生素D3+L-甲硫氨酸三則聯合的方法最終加速了AS的形成，且認為模型一組喂養方式形成的模型更適合建立AS早中晚模型，適用于基礎、臨床多方面研究。

2.2 機械損傷法 基于內皮損傷反應學說，采用機械損傷的方法刺激內皮細胞致其大量損傷，從而導致內皮功能發生紊亂，產生一系列的炎癥反應和內膜反應，最終可形成AS。目前有采用球囊法、氣體干燥法、輻射損傷法成功制作AS模型的報道，其中采用球囊法的報道相對較多。楊炯等[19]利用短期的高脂飲食喂養+球囊損傷的方法成功建立了ApoE-/-小鼠AS模型，且認為該法造模具有周期短、斑塊形成穩定、病變部位明確、與人類AS性質接近等優勢，可作為AS小鼠模型更為合適的造模方法，適用于血管再狹窄的研究。但是球囊法造模也有其缺點，包括技術操作要求高、所形成的斑塊易破裂而形成血栓，球囊的應用不當可能會造成動脈破裂后果。艾志兵等[20]采用高脂飲食聯合氣體干燥法，在高糖高膽固醇飼養日本大耳白兔1周后于頸動脈處進行氣體干燥術，術后繼續高脂飲食喂養，結果發現在第4周、第6周即可出現頸病變。目前關于氣體干燥法在干燥的時間、氣體用量方面沒有達成統一的標準，有待進一步研究。

2.3 免疫損傷法 基于免疫損傷學說，許多學者采用免疫損傷制作AS模型，取得一定成果。張勇等[21]通過靜脈注射牛血清白蛋白(250 mg/kg)+高脂飲食喂養干預日本大耳白兔3周后，血清中TC、LDL-C明顯升高，6周后，肉眼及光鏡下都發現明顯的動脈粥樣斑塊；連偉光等[8]則利用通過牛血清白蛋白(40 mg/kg) 和卵清白蛋白(2.5 mg/kg)進行免疫損傷，并輔以維生素D3(250 U/g)灌胃，經高脂飲食喂養90 d后，成功建立HFJ近交系大鼠AS模型；王衛群等[22]在1周、3周分別經新西蘭白兔鼻腔感染肺炎衣原體，發現肺炎衣原體感染與高脂飲食能誘發及加快AS病變進程。此外許多學者采用內毒素、鼠傷寒沙門氏菌等作為炎性刺激導致免疫損傷，而成功建立AS模型[23-24]。

3 AS中醫濕熱證模型

中醫濕熱證包含外感濕熱與內傷濕熱，常見的證型有脾胃濕熱證、肝膽濕熱證、濕熱下注證等。在濕熱證的形成上，吳鞠通認為“內不能運化水谷之濕，外復感時令之濕”，薛生白則有“太陰內傷，濕飲停聚，客邪再至，內外相引，故病濕熱”的精彩論述。由此可見濕熱證以脾胃為中心，內傷外感共作而致病。《內經·素問·太陰陽明論》：“脾者土也，治中央，常以四時長四藏，各十八日寄治”。長夏為四時之余氣，五臟歸屬于脾，脾主運化水濕。所以根據這些理論，多數學者在制作濕熱證模型時，多注意模擬長夏的氣候特點，改變模型動物喂養環境的濕度和溫度，增加其外感濕熱邪毒的機會；同時應用高脂飲食喂養，制造飲食失節、過食肥甘厚膩的辦法損傷脾胃，致實驗動物脾胃失其運化，達到產生內濕的目的。

吳仕九等[23]提出了飲食+氣候+生物因子(鼠傷寒沙門氏菌)的造模方法，將大鼠高熱量、高膽固醇喂養10 d后放入氣候箱(溫度35 ℃，相對濕度95%)96 h，再灌胃給子鼠傷寒沙門氏菌2 mL/200 g，120 h后再加強感染1次(1 mL/200 g)，成功復制濕熱證模型，并且認為其模型從病因模擬、癥狀體征表現都與中醫濕熱證型相近，且有可重復性及可操作性的優勢[23]。楊開清等[24]以高膽固醇飼料喂養6周+從耳緣靜注內毒素(1 pg/kg，每周1次)的方法，成功制作了新西蘭大白兔濕熱證AS模型，并且認為濕熱內蘊是動脈粥樣硬化(特別是早期)重要的發病機制，濕熱進一步致瘀，所以采用清熱化濕消瘀法是AS治療的主要方法。

總之，依據濕熱證形成中以脾胃為中心，內外合邪而致病理論，結合目前常用制造AS動物模型的方法中高脂飲食喂養方法，加上增加動物生活環境濕度和熱度產生濕熱外邪，可以成功制作既具有中醫濕熱證典型特點，又符合AS病理改變特點的AS動物模型。

4 AS中醫陽虛證模型

中醫陽虛證主要包括心陽虛、脾陽虛、腎陽虛及多者相兼為病。關于陽虛證形成，《黃帝內經·素問·陰陽應象大論》中提到“陰勝則陽病，陽勝則陰病”，基于此中醫多認為陽虛證的形成與過食生冷、久居陰冷潮濕之地、久病陽氣耗傷等后天因素和先天稟賦不足有關。氣屬陽，氣虛為陽虛之漸，陽虛為氣虛之極，氣作為運行于生命周身的無形精微物質，是保持機體生命活力的力量源泉。氣為血之帥，血為氣之母，氣行則血行，氣虛、陽虛無力推動血液運行則血為之瘀，正如《仁齋直指方·血榮氣衛氣論》所說：“蓋氣者，血之帥也。氣行則血行，氣止則血止，氣溫則血滑，氣寒則血凝，氣有一息之不運，則血有一息之不行。”關于陽虛血瘀導致血府(脈管)病變，《靈樞·九針論第七十八》有載“邪入于陰，則為血痹。”《諸病源候論》中亦有記載：“血痹者，由體虛邪入于陰經故也。血為陰，邪入于血而痹，故為血痹也。”《醫林改錯·下卷》中也指出：“元氣既虛，必不能達于血管，血管無氣，必停留而癖。”基于這些理論，多數學者在復制陽虛證動物模型時多通過制造陰冷潮濕的環境、飲食不節等制造陽虛證形成的后天因素，或者通過手術等方式制造陽虛證形成的先天不足因素，以此形成外感寒濕等傷其陽氣、先天不足陽氣不充格局，達到復制陽虛證動物模型的目的。

如李芹等[25]系統綜述了脾陽虛證動物模型的建立方法，包括利用苦寒瀉下藥(大黃、番瀉葉等)灌胃、將動物模型放置在寒濕環境中、連續喂養的飲食失節等法模擬外感內傷病因均能成功制造脾陽虛證模型；還有通過注射利血平等西藥建立脾陽虛模型，并且認為評價脾陽虛模型的癥狀指標包括納差、倦怠少動、大便溏泄、皮毛枯槁、肛溫下降、喜聚堆等。氫化可的松等激素注射及切除動物一側腎臟、腎上腺、睪丸等手術方式也可成功制作陽虛證動物模型[26]。唐漢慶等[27]通過手術切除Wistar大鼠肩胛骨棕色脂肪后1周，在19 ℃的環境刺激下，飼以高脂飼料后大鼠出現畏冷寒戰、喜扎堆、納差、便溏等陽虛癥狀或體征，成功制作冠心病心脾陽虛證。于柏青等[28]利用人工氣候箱模擬西北寒冷干燥環境[人工氣候箱系統溫度設定為(6±2)℃，相對濕度控制在25%～32.8%]，配合高脂飲食成功建立陽虛證AS模型。

通過對目前已發表的文獻檢索發現，復制陽虛證動物模型的方法很多，復制動脈粥樣硬化陽虛證模型的研究則非常少，個別的報道散在冠狀動脈粥樣硬化性心臟病、下肢動脈粥樣硬化性疾病等研究中。基于氣虛血瘀、陽虛血瘀、陽虛寒凝等理論，以及臨床動脈粥樣硬化性疾病氣虛、陽虛證型的較高發病率，許凌之等[3]分析1 264例動脈粥樣硬化病人的中醫證候，提示以氣虛、陽虛為主證，或兼有氣虛、陽虛證的病人比例達到42.09%。因此探索建立具有陽虛特點的動脈粥樣硬化動物模型具有重要意義。

5 小結與展望

醫學動物模型的出現是人們了解疾病發生發展的本質，了解人體生理病理的一把利劍，醫學動物模型的出現是當今醫學飛速發展的一個重要原因，建立醫學動物模型是為了更好地防治疾病、服務臨床，為人類健康保駕護航，但是無論是建立何種醫學動物模型，復制出的模型與疾病表現在人類身上的征象都有一定的差異。所以建立醫學動物模型的關鍵，必須基于研究的目的，遵循目前以了解的疾病發病機制，采取合適的方法盡可能模擬近似人類疾病病理特點的動物模型。因此，無論是建立何種證型的AS動物模型，都必須符合AS的發病機制，符合中醫病因病機特點。基于濕熱證脾胃為中心，內外合邪的致病理論，造模過程中盡可能地模仿內濕外濕致病的先后天因素；基于陽虛證陰勝則陽病的理論，造模也要盡可能地營造能導致陽虛的先后天條件，如此復制出的AS動物模型才能更好地服務于基礎研究、臨床研究。

目前AS動物模型的造模途徑很多，選用的材料與方法各異，模型動物的選擇上，有用大鼠、小鼠，也有用兔、豬、鴿、猴子、鵪鶉等，各小類之間又有不同的區別，它們各有自己優缺點，隨著科學技術的發展，越來越先進的動物模型會不斷涌現，就目前來說，ApoE-/-與 LDL-R-/-等基因敲除小鼠因具有病變過程與人類相似、易于繁殖、維持成本低等優勢，是建立AS模型較好的選擇。在造模方法上，目前方法很多，多數方法都沒有形成統一的標準，比如高脂高膽固醇飼料在具體配伍方面各學者采用不同的比例都成功復制了AS動物模型，一方面說明通過高脂高膽固醇飼喂的方法成功率高、靈活性大，另一方面也說明如何配置出更符合人類飲食特點、盡可能地節約資源、加速AS形成的相關研究欠缺。又比如在構造動物生活環境上，在濕度、溫度等方面采用怎樣的干預措施也有待進一步研究。同時目前也注意到，在濕熱證與AS的研究方面相對較多，構造具有濕熱證特點的AS動物模型方法相對較多，而在陽虛與AS結合的研究則很欠缺，如何構造具有中醫陽虛證特點的AS動物模型是今后應該努力的方向。隨著“濕熱證”與“陽虛證”AS模型的建立，將了解不同證型AS的病理特點。并且基于兩個截然相反的證型，可進一步探討“寒者熱之，熱者寒之”及“同病異治”的中醫特色理論的科學依據。