高效液相色譜串聯質譜法檢測綠茶中的非法添加劑孔雀石綠

劉超，景贊，鄒沫君，黃志勇，馮慧

（樂山市食品藥品檢驗檢測中心，四川樂山614000）

綠茶是我國傳統消費的具有文化底蘊的特色農產品之一[1]，綠茶中不僅富含氨基酸、蛋白質、維生素和礦物質元素，而且含有茶多酚、茶色素、茶多糖等功能性成分[2]，但綠茶儲存期較短，價格隨著季節的波動也較大。

孔雀石綠具有很好的穩定性，通常作為一種工業合成染料用于絲綢、紙張和皮革的制造，然而，目前有些不法商販常在過期的綠茶中使用，以增強穩定性，提高綠茶賣相。據報道，孔雀石綠具有高毒素、高殘留、致癌、致畸、致突變等副作用，被人體吸收后，積累到一定程度，就可能引發各種疾病，如血壓高、心率快、厭食、失眠、肝功能異常等。國內關于孔雀石綠的報道較多，如馬宏飛[3]等研究了茶葉渣作為吸附劑，對孔雀石綠的吸附性能；王艷[4]等研究了綠茶微粉對染料亞甲基藍和孔雀石綠的吸附。這些報道多為對孔雀石綠吸附性能的研究，對綠茶中孔雀石綠檢測方法的研究較少。鑒于此，本試驗建立了液相色譜串聯三重四級桿質譜法檢測綠茶中的孔雀石綠。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乙腈，色譜純，Fisher Chemical提供。PSA，40～60 μm，Dikma提供。C18 粉末，40～50 μm，WELTECH（WUHAN）CO.,LTD提供。乙酸銨，有機純，天津市光復科技發展有限公司提供。無水硫酸鎂，分析純，成都市科龍化工試劑廠提供，CAS：7487-8362。

孔雀石綠標準物質，北京曼哈格生物科技有限公司提供，CAS：2437-29-8，純度 99.1%。

1.2 色譜條件

色譜柱：Kromasil 100-5 C18（150 mm×3.9 mm）。流動相A，乙腈；B，含0.1%乙酸的5 mmol/L乙酸銨。流速，0.4 mL/min。進樣體積，10 μL。梯度洗脫條件見表1。

表1 梯度洗脫條件Table 1 Gradient elution condition

1.3 質譜條件

DGU20A-API3200質譜儀，ESI正離子模式，離子源參數見表2。掃描模式為多反應檢測（MRM），具體參數見表3。

表2 離子源參數Table 2 Ion source parameters

表3 多反應監測參數Table 3 Multi-reaction monitoring parameters

1.4 標準曲線的配制

1.4.1 標準儲備液的制備

精密稱取10 mg孔雀石綠標準物至10 mL容量瓶中，用乙腈溶液配置成1 mg/mL的標準儲備液。

1.4.2 標準工作液的制備

準確吸取0.1 mL的儲備液至10 mL容量瓶中，用乙腈溶液配置成10 μg/mL的標準儲備液。

1.4.3 標準曲線的制備

精密稱取空白樣品0.5 g于50 mL聚四氟乙烯離心管中，加入 5、10、20、25、50、75 μL 標準儲備液和 10 mL乙腈，渦旋60 s后，振蕩提取5 min，超聲提取10 min（功率700 W），期間每隔5 min漩渦震蕩30 s，8000 r/min離心5 min，上清液轉移至25 mL容量瓶中，再加入10 mL乙腈，重復上述過程，上清液合并轉移至同一容量瓶中，用乙腈定容至刻度。稱取 100 mgPSA（40～70 μm）、50 mg無水硫酸鎂、200 mg C18粉末置于10 mL聚四氟乙烯具塞離心管中，移取1.5 mL上清液至此離心管中，渦旋混合1 min，以8000 r/min離心5 min，孔雀石綠濃度范圍為2、4、8、10、20、30 ng/mL。 取 10 L 標 準 點 濃 度 注 入LC-MS/MS中，測定相應的峰面積，以標準工作液的濃度為橫坐標，以峰面積縱坐標，繪制標準曲線并列出線性方程及線性范圍。

1.5 樣品制備

提取：精密稱取試樣0.5 g于50 mL聚四氟乙烯離心管中，加入10 mL乙腈，渦旋60 s后，振蕩提取5 min，超聲提取10 min（功率700 W），期間每隔5 min漩渦震蕩30 s，8000 r/min離心5 min，上清液轉移至25 mL容量瓶中，再加入10 mL乙腈，重復上述過程，上清液合并轉移至同一容量瓶中，用乙腈定容至刻度。

凈化：稱取 100 mgPSA（40～70 μm）、50 mg無水硫酸鎂、200 mg C18粉末置于10 mL聚四氟乙烯具塞離心管中，移取1.5 mL上清液至此離心管中，渦旋混合1 min，以8000 r/min離心5 min，上清液過0.22 μm的有機濾膜，備用。

1.6 檢出限與定量限

精密稱取空白樣品，空白溶液的制備方法同1.6樣品的制備方法。用空白樣品溶液將標準工作液稀釋至產生3倍信噪比（S/N）和10倍信噪比（S/N），根據色譜圖測得信噪比，計算方法檢出限和定量限。

1.7 方法準確性及重復性

低濃度加標回收溶液：稱取0.5 g空白樣品于50 mL聚四氟乙烯離心管中，加入一定量標準工作溶液，然后按樣品制備方法操作，配置成4 ng/mL的質控樣品。

中濃度加標回收溶液：稱取0.5 g空白樣品于50 mL聚四氟乙烯離心管中，加入一定量標準工作溶液，然后按樣品制備方法操作，配置成10 ng/mL的質控樣品。

高濃度加標回收溶液：稱取0.5 g空白樣品于50 mL聚四氟乙烯離心管中，加入一定量標準工作溶液，然后按樣品制備方法操作，配置成20 ng/mL的質控樣品。

1.8 方法精密度

稱取3份0.5 g空白樣品于3個50 mL聚四氟乙烯離心管中，分別在每個離心管中加入標準工作溶液10、20、50 μL，然后按樣品制備方法操作，供試品溶液連續進樣6次，計算峰面積的RSD值。

2 結果與分析

2.1 標準曲線

由圖1可知，孔雀石綠在2～30 ng/mL濃度范圍內，R2值為0.8978，可見，孔雀石綠在該濃度范圍內線性良好，因此選取2～30 ng/mL為本試驗的線性范圍。

2.2 專屬性

目標化合物出峰處無干擾，一級質譜圖、二級質譜圖清晰可見，圖2、3說明該方法專屬性強。

圖1 孔雀石綠的標準曲線Fig.1 Standard curve of malachite green

圖2 孔雀石綠一級質譜圖Fig.2 MS spectra of malachite green

圖3 孔雀石綠二級質譜圖Fig.3 MS2 spectra of malachite green

2.3 檢出限和定量限

采用空白樣品加標準溶液的方法測定[5-8]，孔雀石綠的方法的檢出限為1.77 μg/kg，定量限為5.89 μg/kg。

2.4 方法的準確性及重復性

采用空白樣品加標準回收法測定[5,7]，取濃度分別為4、10、20 ng/mL的質控（QC）樣品 3份，經前處理進樣分析，每種濃度平行進樣6次，測得3種非法添加物的峰面積代入隨行的基質標準曲線，計算濃度，除以理論加入濃度，獲得方法回收率，即準確度結果。測得孔雀石綠的峰面積代入隨行的基質標準曲線，計算濃度及其RSD，獲得重復性結果。從表1我們可以看出，孔雀石綠在高、中、低三個水平回收率均為84.2%～93.1%，重復性RSD＜5%。這表明方法準確性及重復性良好。

圖4 孔雀石綠標準品色譜圖Fig.4 Chromatogram of malachite green

表1 不同質量濃度下的孔雀石綠回收率結果（n=6）Table 1 Recoveries of malachite green at different concentration levels（n=6）

2.5 方法的精密度

表2 方法精密度測定結果Table 2 Method Precision determination results （n=6）

取濃度為 4、8、20 ng/mL的質控（QC）樣品 1份連續測定6次。測得孔雀石綠的峰面積代入隨行的基質標準曲線，計算濃度。由表2可以看出，孔雀石綠精密度均＜3%，表明儀器精密度良好[5,6]。

3 結論

本試驗針對綠茶中孔雀石綠建立了液相色譜-串聯質譜檢測方法，著重考察了該方法的檢出限、定量限、專屬性、線性范圍、準確性、重復性、精密度等指標。結果顯示：該方法在2～30 ng/mL范圍內具有良好的線性；方法檢出限為 1.77 μg/kg；添加濃度在 4、10、20 ng/mL 三個水平條件下的平均回收率在84.2%～93.1%之間；孔雀石綠重復性＜5%，精密度＜3%。該方法具有操作簡單、干擾少、靈敏度高、穩定性好、結果準確等特點，適用于綠茶中孔雀石綠的測定。