納米標記免疫層析技術(shù)在食品快速檢測中的應用進展

□ 李慧琴 易云婷 彭 程 廣州市食品檢驗所

1 引言

食品快速檢測主要針對食用農(nóng)產(chǎn)品、散裝食品、餐飲食品及現(xiàn)場制售食品中禁限用的農(nóng)獸藥、非法添加物質(zhì)、生物毒素、污染物及食源性致病微生物進行快速檢測，是監(jiān)管部門在日常監(jiān)管、專項整治、活動保障等現(xiàn)場檢查工作中的重要手段，可提升執(zhí)法的公信力，并對食源性疾病起到預防作用。

免疫層析技術(shù)是食品快速檢測的一種主要形式，是20世紀90年代初發(fā)展起來的一種新型快速免疫分析技術(shù)[1]，其核心原理是以纖維層析材料為載體，借助毛細管的作用推動檢測樣品在載體上層析移動，使樣品中的目標分析物與載體上的抗體結(jié)合，并通過肉眼檢測或儀器讀取所偶聯(lián)的標記物來判定檢測結(jié)果。目前，該項技術(shù)已廣泛應用于水產(chǎn)品、畜禽肉中獸藥殘留、違禁藥物快速檢測及水果蔬菜等農(nóng)產(chǎn)品的農(nóng)藥殘留快速檢測，食品添加劑及非法添加物的快速檢測；糧食、食用油、乳品中真菌毒素的快速檢測，各類食品中污染物及病原性致病性微生物的快速檢測等領(lǐng)域。

免疫層析技術(shù)從原理上根據(jù)分析目的及分析物大小的不同等可分為兩種類型：雙抗體夾心和競爭法[2]。雙抗體夾心法常用于檢測具有多個抗原表位的大分子抗原，如大分子蛋白質(zhì)、食源致病菌、病毒等；競爭法用于檢測只具有單個抗原表位的小分子抗原，如農(nóng)獸藥殘留、非法添加物等。目前，隨著納米技術(shù)的發(fā)展，納米材料在免疫層析分析技術(shù)中的應用十分普遍，常用于標記抗體抗原，根據(jù)納米顆粒的不同，可將免疫層析技術(shù)分為：膠體金免疫層析技術(shù)、熒光標記免疫層析技術(shù)（熒光微球免疫層析法、量子點熒光免疫層析技術(shù)、時間分辨熒光免疫分析、上轉(zhuǎn)發(fā)光免疫層析技術(shù)等）和磁珠免疫層析技術(shù)。本文主要針對以上標記免疫層析技術(shù)的研究熱點及最新的研究方向和成果進行論述。

2 膠體金免疫層析技術(shù)

膠體金免疫層析技術(shù)就是以膠體金為標記物對目標物進行定性或半定量測定的免疫層析方法。膠體金是由氯金酸（HAuCl4）在還原劑如白磷、抗壞血酸、枸櫞酸鈉及鞣酸等的作用下，聚合成為特定大小的金顆粒，并由在靜電作用下成為一種穩(wěn)定的膠體狀態(tài)。膠體金在弱堿環(huán)境下帶負電荷，可與蛋白質(zhì)分子的正電荷基團形成牢固的靜電結(jié)合體，并且不影響蛋白質(zhì)的生物特性。膠體金免疫層析試紙條以其簡便、快速、便攜及、結(jié)果易判讀等特點，在食品安全快速檢測領(lǐng)域發(fā)揮著重要作用，已經(jīng)商品化的膠體金免疫層析試紙條包括：檢測瘦肉精、氯霉素、孔雀石綠、硝基呋喃類、磺胺類及喹諾酮類等獸藥殘留的膠體金快速檢測試紙條；檢測部分菊酯類、有機氯類、殺菌劑類、有機磷類及氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留的膠體金快速檢測試紙條；檢測黃曲霉毒素B1、赭曲霉毒素A、嘔吐毒素等真菌毒素的膠體金快速檢測試紙條；檢測羅丹明B、罌粟殼等非法添加物的膠體金快速檢測試紙條；檢測沙門氏菌、大腸桿菌O157：H7等食源性致病微生物的膠體金快速檢測試紙條。但是膠體金免疫層析試紙條仍存在不可忽視的缺點，例如應用在一些限量要求較苛刻的檢測項目中時，其靈敏度達不到要求，且只能實現(xiàn)定性或半定量,多為單一組分測定等。目前有研究在原有技術(shù)的基礎上通過采用添加增敏劑或引入生物素-親和素系統(tǒng)以提高檢測信號的靈敏度[3,4]，另外，可采用多膜復合受體或單膜多元受體固定的方式實現(xiàn)多元測定[5]。

3 熒光標記免疫層析技術(shù)

熒光標記免疫層析技術(shù)，是熒光免疫標記技術(shù)與傳統(tǒng)免疫層析技術(shù)相結(jié)合的一種新型定量檢測技術(shù)。該技術(shù)既保留了膠體金免疫層析技術(shù)簡便、快速、便攜的優(yōu)點，又通過熒光示蹤增強技術(shù)實現(xiàn)了定量檢測。熒光免疫標記可以用熒光素直接標記，也可以用熒光微球標記。傳統(tǒng)的熒光染料異硫氰酸熒光素（FITC)、四乙烯基羅丹明、四甲基異硫氰酸羅丹明等具有光學性質(zhì)不穩(wěn)定,容易發(fā)生光漂白，熒光量子產(chǎn)率較低，吸收波長較短等缺點，限制了它們的廣泛應用，而量子點、時間分辨微球、上轉(zhuǎn)發(fā)光材料等新型熒光標記物在食品安全快速檢測中具有更好的應用前景。

3.1 量子點熒光微球免疫層析技術(shù)

量子點（Quantum dots，QDs）是一種半導體納米晶體，是由II-Ⅵ族元素（如CdS、CdSe、CdTe、ZnSe及ZnS等）或Ⅲ-Ⅴ族元素（無鎘量子點，如InP、InAs等）等半導體材料構(gòu)成，也可由兩種或兩種以上的半導體材料構(gòu)成核/殼結(jié)構(gòu)（如常見的CdSe/ZnS核/殼結(jié)構(gòu)量子點等）。QDs能夠接受接收激發(fā)光，產(chǎn)生熒光，其中研究較多的主要是CdX（x=S、Se、Te）[6]。作為一種新型熒光標記材料，基于表面活潑基團的修飾，可與生物大分子進行偶聯(lián)，與傳統(tǒng)熒光染料相比，QDs具有一元激發(fā)多元發(fā)射、激發(fā)光譜寬、發(fā)射光譜窄而對稱、光穩(wěn)定性好和抗漂白能力強等特點。而將大量QDs包裹于聚合物材料制備得到的量子點微球則可表現(xiàn)出更高的熒光強度和更好的光學穩(wěn)定性。與傳統(tǒng)免疫層析技術(shù)多個指標需要對應多個T線不同的是，基于QDs的多重檢測可在僅設置一條T線和一條C線的前提下實現(xiàn)。

丁喬棋等[7]以羧基化CdTe/ZnSe量子點熒光微球為標記物，通過EDC/NHS法將氯霉素（CAP）單克隆抗體與量子點熒光微球偶聯(lián)制備熒光探針。氯霉素全抗原（CAP-HS-BSA）及羊抗鼠二抗分別噴涂硝酸纖維素膜，形成檢測線（T線）和質(zhì)控線（C線），組裝成新型氯霉素量子點熒光微球免疫層析試紙條，建立了可在15 min快速、定量檢測牛奶中氯霉素CAP的方法。周耀鋒等[8]采用EDC法將抗赭曲霉毒素A（OTA）腹水與量子點熒光微球偶聯(lián)，制備熒光探針，以牛血清白蛋白-OTA偶聯(lián)物及驢抗鼠二抗噴涂硝酸纖維膜形成試紙條T線C線，建立了基于T/C熒光強度比值法的高靈敏度、快速定量檢測玉米中OTA的免疫層析新方法。

3.2 時間分辨熒光免疫層析技術(shù)

時間分辨熒光微球（Timeresolved fluorescent nanobeads，TRFN）是基于鑭系元素的新型標記材料，其在延遲時間的幫助下可區(qū)分特異性熒光信號和非特異性背景熒光信號[9]。目前使用的鑭系元素離子有Eu3+、Tb3+、Sm3+和 Dy3+，它們作為標記材料的原理是熒光反應，其納米顆粒與膠體金的尺寸相當接近，并且消除了背景熒光，因而被選為免疫層析的新型標記材料。與常規(guī)的熒光標記和量子點相比，它們的熒光特性具有獨特的應用優(yōu)勢，例如熒光壽命長、發(fā)射光譜窄、斯托克斯位移大及光穩(wěn)定性突出等。

張東升等[10]以Eu3+螯合物的納米微球為熒光探針標記抗嘔吐毒素（DON）單抗，采用競爭抑制建立DON時間分辨熒光免疫層析定量方法，與免疫親和凈化--高效液相色譜法同時測定DON含量，結(jié)果無明顯差異。樊曉博等[11]通過雙功能螯合劑異氰酸芐基二乙烯三胺四乙酸絡合稀土元素Eu3+，標記抗AFB1的單克隆抗體，以AFB1-OVA為固相抗原，優(yōu)化反應條件，建立直接競爭時間分辨免疫層析檢測黃曲霉毒素B1的高靈敏度、特異性強的方法。賴科陽等[12]通過對時間分辨熒光微球偶聯(lián)克倫特羅抗體量、CLE-BSA抗原用量、微孔內(nèi)CLE抗體-TF R N探針體積的優(yōu)化，建立了定量檢測克倫特羅的時間分辨熒光微球免疫層析法。

3.3 上轉(zhuǎn)發(fā)光免疫層析技術(shù)

上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料（Up-Converting Phosphor，UCP）是一種有稀土元素摻雜的熒光納米材料，能夠?qū)⒌湍芰康慕t外光轉(zhuǎn)化為高能量的可見光[13]。與傳統(tǒng)的下轉(zhuǎn)換發(fā)光相比，具有寬的反斯托克斯位移，無本底干擾，可顯著提髙檢測的信噪比，不易光解和光漂白，顆粒本身無毒性，應用于免疫層析可同時具有定量、靈敏、無干擾的優(yōu)點。

王瑜等[14]合成上轉(zhuǎn)換納米顆粒（UCNPs）-NaYF4：Yb，Er，表面功能化修飾后與己烯雌酚（DES）單克隆抗體偶聯(lián)，形成熒光探針，以牛血清白蛋白-己烯雌酚（BSA-DES）偶聯(lián)物和羊抗鼠二抗分別噴涂硝酸纖維膜，形成試紙條T線、C線，建立了上轉(zhuǎn)換發(fā)光免疫層析試紙條快速定量檢測DES的方法，與高效液相色譜法有較好的一致性。姜會聰?shù)萚15]以上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料（UCP）為新型標記物，采用戊二醛法偶聯(lián)單克隆抗體（mAb），制備UCP-mAb復合物，并以其作為探針，基于小分子競爭結(jié)合，成功構(gòu)建了上轉(zhuǎn)換免疫層析法用于檢測雌二醇。李春鳳等[16]以上轉(zhuǎn)發(fā)光納米顆粒（UCP-NPs）作為示蹤物，基于雙抗體夾心檢測模型，研制針對甲型副傷寒沙門氏菌、乙型副傷寒沙門氏菌、大腸埃希菌O157∶H7、副溶血弧菌4種靶標菌的上轉(zhuǎn)發(fā)光免疫層析試紙，簡便快速，具有良好的敏感性、特異性和線性定量能力，可滿足食品安全檢測的要求。

4 磁珠免疫層析技術(shù)

超順磁性納米顆粒（Superparama gnetic nanoparticles，SPIONs）是一種納米級的磁性顆粒，其內(nèi)部含有磁性金屬氧化物（如鐵、鈷、鎳及其化合物）的超細粉末，而表面由有機高分子材料結(jié)合起來，形成了具有一定磁性及特殊結(jié)構(gòu)的微球[17]。，在其表面還能修飾多種具有生物活性的功能基團（氨基、羧基、醛基等），可以選擇性的與抗原、抗體、生物素、和親和素等通過選擇適合的交聯(lián)劑和交聯(lián)方式進行結(jié)合。在食品檢測中的應用比較多的是磁性微球的分離、富集、濃縮的功能，尤其是在致病菌檢測方面。而磁性微球的具有強磁性及單分散性等特點，應用在免疫層析系統(tǒng)中可以極大地提高監(jiān)測分析的靈敏度、穩(wěn)定性和可重復性。以超順磁性微球作為信號標記物，可以通過肉眼快速定性分析，也可利用磁信號通過磁性免疫層析分析系統(tǒng)進行定量化檢測[18]。

黃艷梅等[19]以噴涂了檢測抗原黃曲霉毒素M1-BSA和驢抗鼠二抗形成檢測線和質(zhì)控線的硝酸纖維膜制備免疫層析試紙條，采用EDC/NHS法制備偶聯(lián)了抗黃曲霉毒素M1單克隆抗體的免疫磁珠。免疫磁珠與待檢樣本混合，經(jīng)捕獲、磁分離后，濃縮重懸液直接用免疫層析試紙條檢測原料乳中的黃曲霉毒素M1。劉道峰等[20]在磁性納米顆粒上偶聯(lián)抗豬霍亂沙門氏菌單克隆抗體，通過檢測線（T線）噴涂豬霍亂沙門氏菌外膜蛋白，利用待檢物與T線抗原的競爭關(guān)系，建立了針對大分子靶標的競爭型免疫層析法，用于豬霍亂沙門氏菌的檢測；同時基于磁性納米顆粒，研究建立了新型的兩步免疫層析法，高抗體偶聯(lián)量的免疫磁性納米顆粒可用于捕獲原料乳中的黃曲霉毒素M1（AFM1），熱洗脫后采用低偶聯(lián)量的免疫納米顆粒指示結(jié)果，靈敏度較膠體金標記的免疫層析法提高50倍。

5 免疫層析技術(shù)在食品快速檢測中的發(fā)展方向

目前，隨著熒光定量和磁信號定量在食品快速檢測中的研究不斷深入，納米標記免疫層析技術(shù)將發(fā)揮越來越重要的作用，這類技術(shù)將朝著高靈敏度、定量分析、多元檢測、及層析系統(tǒng)集成化等方向發(fā)展。①提高免疫層析技術(shù)的靈敏度可以通過選用靈敏度更高的標記物、加入顯色增強劑、發(fā)展信號放大系統(tǒng)、及濃縮樣品等方式來實現(xiàn)。②利用磁珠、熒光素標記物的試紙條進行定性或定量分析時，需要儀器設備對光信號、磁信號進行辨識，例如市面上已有的UPT上轉(zhuǎn)發(fā)光免疫分析技術(shù)平臺、磁信號分析儀、熒光免疫層析讀數(shù)儀，而微型便攜化、智能化、集成化定量檢測儀器研究成為免疫層析檢測領(lǐng)域的新趨勢。③多元化檢測是指一次可以檢測兩種或兩種以上的待測物的方法[21]。免疫層析技術(shù)實現(xiàn)多元化檢測可從以下方面進行深入研究：根據(jù)待測物的共同結(jié)構(gòu)設計、制備廣譜性抗體；利用單克隆抗體技術(shù)或基因工程抗體技術(shù)制備雙特異性抗體；采用一膜包被多條抗體帶的方法以及利用不同的信號探針分別對不同的抗體或抗原進行標記。④由于食品樣品基質(zhì)復雜，其會影響結(jié)合墊上指示物質(zhì)的釋放，而硝化纖維膜等試紙條上的組成結(jié)構(gòu)復雜、不均勻以及存在非特異性吸附反應，會使溶液的層析以及檢測結(jié)果產(chǎn)生差異。研究微流控芯片中的表面修飾和抗體固定技術(shù)，將免疫層析方法建立在微流控芯片平臺上，制成微流控免疫層析芯片，以提高靈敏度和重復性，也將是未來研究的一個方向。