“第六堿基”
——5-羥甲基胞嘧啶研究進展

夏 婭 ，樊丹平 ，戴自城 ，肖 誠 *

（1.北京中醫藥大學，北京 100029；2.中日友好醫院臨床研究所，北京 100029；3.中國醫學科學院 北京協和醫學院研究生院，北京 100730；4.香港理工大學應用生物及化學工程系，中國香港）

表觀遺傳學是目前生物領域最熱門的研究之一，其中DNA甲基化是表觀遺傳學修飾的一種重要方式[1]，指在DNA分子中加入甲基的過程。大量研究表明，DNA甲基化可引起DNA構象、染色質結構、DNA穩定性以及DNA與蛋白質相互作用方式的改變，從而調控基因表達[2]。遺傳信息載體DNA由腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶4種堿基組成，胞嘧啶 （cytosine，C）可在DNA甲基化轉移酶（DNA methyltransferases，DNMTs）的作用下發生甲基化，生成 5-甲基胞嘧啶（5-methylcytosine，5mC）。 5mC是一種表觀遺傳修飾機制，意指在核苷酸序列不發生改變的情況下，基因表達的可遺傳的變化，被稱為“第五堿基”。

5-羥甲基胞嘧啶 （5-hydroxymethylcytosine，5hmC）是由甲基胞嘧啶雙加氧酶 （ten-eleven translocation proteins，TETs）介導的，5mC的羥甲基化形式，是DNA去甲基化的中間產物，被稱為“第六堿基”，同樣發揮著表觀遺傳修飾的重要作用[3]。5hmC在不同組織中表達各異，其在脊髓和中樞神經中含量最高，在腎臟、心臟、肺部、骨骼肌、膀胱和鼻上皮細胞的含量居中，而脾臟、肝臟和內分泌腺中的含量最低。隨著對TETs功能的認識逐漸加深，5hmC的表觀遺傳作用日益受到科學界重視。

1 5hmC的生成與去甲基化

1953年，Wyatt GR和Cohen SS在T2噬菌體DNA中發現5hmC[4]。半個多世紀后，Kriaucionis S和Heintz N在小鼠神經元和腦組織DNA內也發現了5hmC[5]。5hmC在哺乳動物內的相關科學研究隨之展開。

5hmC曾被認為是DNA受損的產物[6]，但之后的研究推翻了這種觀點。爾后去甲基化酶TETs的發現，為理解5hmC的生成提供了新的視點。TETs屬于α-酮戊二酸加氧酶家族，依賴Fe2+作為輔助因子，將底物的雙電子氧化作用與α-KG的氧化脫羧作用相結合[7]。TETs包含TET1、TET2、TET3 3種具有組織表達特異性的亞型，能在不同的組織或細胞中將5mC逐漸氧化轉變為5hmC。其中TET1存在于單細胞胚胎到囊胚期，主要位于細胞核內，且N端含有一個保守CXXC鋅指結構域可與染色體相互作用[8]。有研究報道，小鼠原始生殖細胞中的DNA在TET1和TET2高水平的驅動下，通過將5mC轉化成5hmC來實現全面去甲基化[9]。TET3在小鼠雄性原核階段特異性表達，其介導的DNA羥甲基化作用參與自然受精后合子父本DNA的表觀遺傳重編[10]。正常情況下，基因組中大部分的5hmC來源于之前存在的5mC，并在TETs的作用下保持DNA甲基化狀態的動態平衡。

DNA甲基化通過招募基因表達蛋白，或抑制轉錄因子與DNA的結合來調控基因表達，使細胞分化為穩定而獨特的甲基化模式[11]。在某些情況下，DNA甲基化水平可以通過涉及活性DNA去甲基化的機制迅速改變。5hmC生成是去甲基化的關鍵環節，它既可以通過DNA復制被被動消耗，也可以通過迭代氧化和胸腺嘧啶DNA糖基化酶介導的基底切除修復被主動還原為胞嘧啶[12]，還可以作為活躍的氧化去甲基化的中間產物。目前關于5hmC在DNA去甲基化過程中的作用機制主要有兩種可能方式：第一種是5hmC在TETs介導下參與了主動去甲基化過程；第二種是細胞生長過程中5hmC的存在影響了DNMT1介導的DNA甲基化過程，被動參與DNA的去甲基化[13]。

2 不同技術檢測5hmC在哺乳動物體內不同組織的分布及基因分布特點

2.1 組織分布特點

Szwagierczak[14]采用放射標記法對小鼠不同成體組織和分化胚胎干細胞中的5hmC水平進行了檢測，研究結果表明：基因組5hmC的最高水平出現在大腦區域，其中皮質、海馬、小腦區約占0.9%～1.3%；腎臟內水平也較高，達到了0.8%；肺組織和肝組織為0.3%～0.4%。此外，Globisch等[15]采用HPLC-MS分析和免疫組化方法，發現實驗小鼠所有組織和細胞中均存在5hmC，且濃度最高的是在中樞神經系統的神經元細胞中，為0.3%～0.7%；脊髓DNA中的5hmC為0.47%；腎臟、鼻腔上皮、膀胱、心臟、骨骼肌和肺部的DNA中5hmC為0.15%～0.17%；肝臟、脾臟和內分泌腺 （睪丸和垂體）的DNA中5hmC含量最低，為0.03%～0.06%。在人體內Li等[16]通過免疫測定發現不同組織中5hmC的含量存在顯著差異：其中大腦 （0.67%）、腎組織（0.38%）、結腸組織（0.45%）、直腸組織（0.57%）和肝組織（0.46%）中5hmC含量豐富；肺中含量較低，約0.14%；心臟、乳腺、胎盤中5hmC含量極低，均在0.05%左右；且癌組織內含量較正常組織顯著降低。雖然不同時期各組實驗檢測出來的數據都有一定的差異，但是不同組織內5hmC豐度大致可分為 3 類：（1）高豐度組：腦組織、脊髓；（2）中豐度組：腎、直腸、結腸、骨骼肌；（3）低豐度組：心臟、脾、內分泌腺、胎盤。而肝和肺的5hmC含量在不同檢測中差異較大，需進一步精確測定。

2.2 基因分布特點

越來越多的證據表明，5hmC在胚胎干細胞等細胞類型中大量存在，通過5hmC基因組圖譜檢測將有利于進一步了解5hmC的功能。Stroud等[17]通過hmeDIP-seq生成了人類胚胎干細胞中5hmC的全基因組圖譜，測序后發現有3028個增強子與5hmC峰重疊，多效性因子NANOG和OCT4結合位點以及絕緣體結合蛋白CTCF位點均富集了5hmC，這說明5hmC在增強子及轉錄因子結合位點上高度富集。Jin等[18]通過應用免疫沉淀技術檢測人腦額葉組織DNA中5hmC的發生情況，結果發現5hmC富集在啟動子和基因體區域，尤其是非編碼區。對于CpG含量中等或較高的啟動子，轉錄起始位點的5hmC峰值與基因表達水平無關。與5mC相比，5hmC對基因的靶向性更強，且5hmC在基因體中的存在與基因表達水平呈正相關。因此，我們有理由認為，5hmC可能與多種調控因子和調控過程有關。

3 5hmC的生理功能

噬菌體DNA的5hmC修飾可以避免其在感染大腸桿菌宿主的過程中受到限制和降解[19]。哺乳動物大腦中5hmC表達豐富，說明它在調控腦組織的發育方面發揮著特殊作用。對胚胎小鼠大腦神經元研究后發現，5hmC在神經元分化過程中增加，且常伴隨著H3K27me3的損失，而這一狀態會促進大腦發育[20]。與該結果一致，缺乏TET1的小鼠表現出海馬神經受損，并伴有學習和記憶障礙[21]。另有研究發現，TETs蛋白是早期胚胎分化的關鍵調節因子。誘導胚胎干細胞分化的刺激會引起TET1、TET2表達丟失，以及基因組5hmC的丟失。相反，成纖維細胞轉化為誘導多能干細胞與TET 1、TET 2和5 hmC的增加有關[22]。

雖然5hmC在哺乳動物和人體內的作用和作用機制尚未完全清楚，但其對基因表達的調控，神經元的促進是肯定的。一旦這種生理狀態被破壞，就會導致疾病的產生。

4 5hmC相關疾病的研究

4.1 5hmC與腫瘤

甲基化狀態的改變被認為與失活抑癌基因和激活原癌基因有關，從而導致腫瘤的發生。5hmC作為DNA去甲基化的中間體，在機體中的含量和分布甚至已經開始被作為多種腫瘤疾病早期診斷和預后的新標志之一[23]。研究發現降低TET1的水平和活性，從而導致5hmC水平降低，與造血系統惡性腫瘤、結腸癌、乳腺癌、前列腺癌、肝癌和肺癌相關，并且乳腺癌的侵襲率增加是TET1下調的直接后果。在各種骨髓惡性腫瘤也發現了TET2突變及5hmC水平降低[24]。在肺癌中，隨著肺癌發病進程的推進，5hmC呈階段性逐漸減少；肝癌和胰腺癌組織細胞內羥甲基化狀態也會發生特異性改變[25]；結直腸和胃腫瘤樣本中5hmC豐度較正常組織平均降低85%和64%[26]；在T細胞淋巴瘤（T-cell lymphoma，TCL）中，可檢測到 5hmC 水平降低，且這種改變與參與調控胞嘧啶甲基化的基因突變無關[27]；黑色素瘤患者5hmC的表達也有相似的結果，同時發現晚期黑色素瘤患者5hmC表達較早期少，且已發生轉移的黑色素瘤患者的5hmC較未發生轉移的患者表達少[28]；其他如鱗狀細胞癌、甲狀旁腺腺瘤等腫瘤中均可檢測到5hmC表達降低。這些研究結果也進一步說明5hmC與腫瘤疾病密切相關。

4.2 5hmC與神經系統疾病

之前的研究曾指出，腫瘤的發生會大量消耗5hmC，然而膠質瘤是一個例外。膠質瘤是一種惡性腦部腫瘤，與其他腫瘤相比，膠質瘤中5hmC水平相對較高。因為膠質母細胞發育需要TET1介導的5hmC的產生，而5hmC招募與亞甲基化相關的PRMT1（CHTOP）染色質靶蛋白，該蛋白使組蛋白H4上的精氨酸甲基化，從而激活癌癥相關基因的轉錄[29]。另外有研究通過氣相色譜/質譜聯用技術檢測正常和癡呆患者的腦組織DNA，并對5hmC進行定量分析，結果發現阿爾茨海默病患者腦組織DNA中5hmC水平發生了顯著變化，且不同分期表現不同[30]。有研究還發現5hmC介導的DNA去甲基化途徑可能參與雷特綜合征的發病機制[31]。說明5hmC可能與年齡相關性神經退行性疾病有關。

4.3 5hmC與自身免疫性疾病

對系統性紅斑狼瘡 （systemic lupus erythematosus，SLE）患者CD4+T細胞進行基因組羥甲基化分析發現[32]：SLE患者CD4+T細胞基因組DNA中5hmC水平升高，且在細胞啟動子區檢測到2748個5hmC表達上調的基因。而這些基因多在神經營養素信號、WNT信號、MAPK信號、鈣信號和mTOR信號通路等關鍵通路中富集。同時，還可發現TET2、TET3表達上調。

5hmC 和類風濕關節炎（rheumatoid arthritis，RA）也表現出潛在的關系。最近一項研究表明，TET2可通過維持基因組5hmC水平調節破骨細胞分化。TET2敲除的小鼠體內有破骨細胞功能受損的表現，如骨硬化，骨量增加；且在不同基因組位點5hmC表達水平不同[33]。RANKL/OPG是破骨細胞發育的重要調控因子，有研究表明，CpG島甲基化的改變會導致RANKL/OPG基因發生差異性表達[34]。而破骨細胞的分化水平與RA密切相關，可以猜測，5hmC可能參與RA的病理變化過程。

5 結語

DNA甲基化對于人類細胞分化、發育過程的重要性得到了普遍認同，在神經系統疾病、腫瘤及系統性紅斑狼瘡等多種疾病的發病機制中也開展了較為深刻的研究。很長一段時間以來，5mC被視為DNA共價修飾的唯一方式，但是5hmC及TETs的發現推翻了這種觀點。作為后起之秀的5hmC，其相關研究也在逐漸深入，科學技術的發展將5hmC表觀遺傳作用提升到一個更加精確的維度，且現有研究已顯示5hmC在多種疾病組織內的表達發生了特異性改變。目前文獻中關于5hmC與RA、銀屑病、糖尿病的報道尚無，但這些疾病均與DNA甲基化具有相關性，因此5hmC在疾病中的變化還需要進一步深入研究，同時也希望5hmC的研究能為疾病的診療帶來新的突破。