放射免疫法在羊妊娠診斷上的應(yīng)用

于克媛 李樂軍 王紀(jì)寶

（山東省聊城市東昌府區(qū)畜牧獸醫(yī)局 252000）

家畜妊娠的早期診斷是改善飼養(yǎng)管理和提高繁殖效率的一項(xiàng)重要技術(shù)措施。國(guó)內(nèi)母羊的妊娠檢查大多采用直腸觸診法。放射免疫測(cè)定是20 世紀(jì)70年代開始建立起來的家畜早期妊娠診斷技術(shù)。早期RIA 法雖然精確度較高，早期妊娠診斷也迅速，但操作復(fù)雜又有放射性危險(xiǎn)[1]。現(xiàn)在隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，RIA 法診斷試劑盒的應(yīng)用，其操作步驟簡(jiǎn)化，并且保護(hù)措施完善，將逐步取代直腸檢查等方法進(jìn)行家畜早期妊娠診斷。

1 放射免疫測(cè)定的原理

羊妊娠診斷的方法主要有陰道檢查法、尿液化驗(yàn)法、腹腔檢查法、免疫測(cè)定法。但早期診斷是免疫測(cè)定法，其原理是根據(jù)乳汁中P4 值進(jìn)行判斷，大于8.3ng/ml 判定為妊娠，小于8.3ng/ml 判定為空懷。對(duì)于一般的診斷方法不能確定是否已受孕母羊，用放射免疫分析法檢測(cè)血液中和乳汁中的內(nèi)分泌指標(biāo)——P4 的水平測(cè)定[1]。P4 主要是母畜卵巢上黃體及胎盤產(chǎn)生的一種類固醇激素，促進(jìn)生殖道發(fā)育，給胚胎提供一個(gè)有利條件，能維持胚胎發(fā)育。RIA 檢測(cè)懷孕羊時(shí)，血液和乳汁中的P4 含量會(huì)逐漸增高，未懷孕的羊也有這種情況，但升高的數(shù)值很低。16d 后未懷孕的羊P4 值會(huì)下降，而懷孕的羊會(huì)繼續(xù)升高。

2 RIA在羊妊娠的診斷上的應(yīng)用

2.1 實(shí)驗(yàn)方法

2.1.1 樣本采集

將母羊圈養(yǎng)在一起飼養(yǎng)，讓其自由采食青草、干草和飲水，下午1 點(diǎn)對(duì)母羊進(jìn)行耳緣靜脈采血3ml。間隔4d 進(jìn)行一次采血，連續(xù)1 個(gè)發(fā)情周期，每只母羊采血4 次。

2.1.2 樣本處理

血樣放置在0～4℃冰箱中1h 后離心機(jī)進(jìn)行分離血清，然后轉(zhuǎn)移入1.5ml 一次性滅菌塑料離心管中備檢。

2.1.3 激素測(cè)定

羊早期妊娠診斷的方法，在實(shí)際操作中常采用測(cè)定乳汁和乳脂中P4 值，根據(jù)乳汁中P4 值進(jìn)行判斷。將樣品按放射免疫分析法送檢，RIA 試劑盒進(jìn)行測(cè)定乳中和血液中黃體酮和雌二醇的含量。

2.2 測(cè)定乳汁中P4 值

應(yīng)用放射免疫法，分別測(cè)定8 只奶山羊發(fā)情同期和160 只奶山羊妊娠早期下午末乳的黃體酮水平[2]。8 只母羊發(fā)情0～1d的黃體酮水平最低，均值為（0.81±0.29）ng/ml，發(fā)情后第5 天上升，在第11～17 天達(dá)峰值分別為32.3、23.5、15.7、12.5 和34.3ng/ml，之后又驟然下降，數(shù)值恢復(fù)到下一發(fā)情周期前的基礎(chǔ)水平。人工授精后15～29d 的黃體酮值在0.32～42.4ng/ml 波動(dòng)。根據(jù)受精后生產(chǎn)羔羊的情況進(jìn)行觀察，生產(chǎn)羔羊配種后22～25d 的黃體酮均維持較高水平，均值≥8.3ng/ml，而未產(chǎn)羔羊這4d 的黃體酮水平較低，平均值是8.3ng/ml。故以8.3ng/ml的黃體酮值為判定界限，大于8.3ng/ml 判定為妊娠，小于8.3ng/ml 判定為空懷。

2.3 測(cè)定血液中的P4 值

在母羊受精后20d 左右靜脈采血，每頭采血1ml，自然析出或者離心機(jī)分離血清，如果不是立即測(cè)定要加入防腐劑硫柳汞，冷凍保存24h，測(cè)定P4 值。妊娠診斷準(zhǔn)確度可達(dá)90%，空懷診斷準(zhǔn)確度可達(dá)100%。以3.0ng/ml 的黃體酮值為判定界限，大于3.0ng/ml 判定為妊娠，小于3.0ng/ml 判定為空懷[1]。經(jīng)實(shí)踐檢驗(yàn)，該法測(cè)定的妊娠診斷準(zhǔn)確率達(dá)75%。因此，對(duì)于有條件的羊飼養(yǎng)場(chǎng)，尤其是經(jīng)濟(jì)條件較好的種羊繁殖單位，可以RIA 作為羊早期妊娠診斷的一個(gè)參考指標(biāo)。

3 RIA 的影響因素及前景

自1973年Heap 等用放射免疫測(cè)定法檢測(cè)牛乳黃體酮以來，此法已成為監(jiān)控母羊繁殖活動(dòng)的有效手段，我國(guó)也開始應(yīng)用于家畜的妊娠診斷[3]。由于卵巢功能黃體的存在是P4 測(cè)定的基礎(chǔ)，往往會(huì)因?yàn)榘l(fā)情期的縮短和延長(zhǎng)而誤將非妊娠的羊只診斷為妊娠。某些卵巢疾病、早期胚胎死亡、流產(chǎn)等都會(huì)降低妊娠診斷的準(zhǔn)確性。早期的放射免疫法需要昂貴儀器和輻射防護(hù)，難以在生產(chǎn)現(xiàn)場(chǎng)推廣使用。

現(xiàn)在隨著科技的發(fā)展，放射免疫法主要是試劑盒診斷，而且操作比較簡(jiǎn)單，保護(hù)措施更完善。近年來研究出濾紙片乳汁的定量分析技術(shù)，妊娠診斷的準(zhǔn)確性已達(dá)到83%～91.6%[2]。由于濾紙方便攜帶，為基層畜牧單位應(yīng)用RIA 對(duì)母畜妊娠檢查提供便捷。RIA 法將逐步代替直腸檢查和超聲波檢查[3]。此法可以更好地減少母羊漏配，提高羊的繁殖速度，提高經(jīng)濟(jì)效益。放射免疫測(cè)定法其特點(diǎn)是特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確度高、取樣少、測(cè)定樣品多。

4 小結(jié)

在畜牧業(yè)生產(chǎn)中，如何能對(duì)家畜妊娠的進(jìn)行準(zhǔn)確的早期診斷，從而提高畜牧業(yè)生產(chǎn)和經(jīng)濟(jì)效益，這是所要研究和解決的重要問題之一。隨著畜牧方面科學(xué)的不斷發(fā)展，一些更好的家畜妊娠診斷法得到應(yīng)用。羊人工授精后不久要進(jìn)行妊娠診斷，對(duì)縮短產(chǎn)羔間隔，提高繁殖效率具有重要意義。雖然超聲波探測(cè)技術(shù)可用于羊的早期妊娠，但昂貴的儀器和較復(fù)雜的現(xiàn)場(chǎng)操作，導(dǎo)致其實(shí)際應(yīng)用范圍有限。而應(yīng)用RIA 試劑盒進(jìn)行測(cè)定操作比較簡(jiǎn)單，保護(hù)措施更完善，實(shí)驗(yàn)檢測(cè)出的結(jié)果更加準(zhǔn)確。