誘導性多功能干細胞在皮膚科研究與應用的進展

李遇梅 張怡萱 劉莉萍

江蘇大學附屬醫院皮膚科 鎮江市免疫性皮膚病重點實驗室，江蘇鎮江 212000

誘導性多功能干細胞（induced pluripotent stem cells，iPSC）是通過向體細胞中導入一些特定的多能性轉錄因子使其重編程為干細胞，擁有類似胚胎干細胞（embryonic stem cells，ESC）的特征，具有多能分化性［1］。ESC雖然具有全能分化性，但由于它來自胚胎，在應用至細胞治療時無可避免會存在倫理學爭議，另外組織相容性問題也是它應用于臨床的另一障礙［2］，而iPSC 可以更少涉及倫理學爭議。在適當條件下，iPSC可以向三胚層多種細胞類型分化，其中包括皮膚細胞如成纖維細胞、角質形成細胞和黑素細胞等。利用iPSC 可以構建疾病模型，在體外用于藥物篩選。因此，源自患者的iPSC 是研究和治療不同疾病的理想來源。而且，iPSC可以提供一種將再生醫學應用于皮膚領域的新方式，為諸如大皰性表皮松解癥、外胚層發育不良等基因相關性皮膚病提供新型干細胞診療手段。

一、iPSC的產生與應用概述

繼2006年鼠源性成纖維細胞通過病毒法導入特定轉錄因子而成功重編程為iPSC 后，人源性成纖維細胞、角質形成細胞、黑素細胞、毛囊外根鞘細胞等皮膚及附屬器相關細胞陸續被重編程為iPSC［1］。重編程的iPSC具有以下特征［2-3］：①形態類似ESC，如細胞呈緊密的扁平克隆樣生長，具有清晰的圓形邊緣，細胞核突出并具有較高的細胞核質比；②核型表達正常；③表達多能性基因及蛋白；④在表觀遺傳學方面，重編程因子被認為激活了轉錄因子網絡，使八聚體結合轉錄因子4 和NANOG 基因啟動子序列去甲基化；⑤體內畸胎瘤形成實驗證明，iPSC可以向內胚層、中胚層和外胚層分化。

iPSC 轉錄因子最初是將可以誘導ESC 并維持多能性的24 個基因作為候選基因用于重編程，最后確定4個關鍵基因作為轉錄因子，用于轉染體細胞，能夠產生類似于ESC 的細胞，分別是OCT4、SOX2、KLF4 和c-MYC。用相似或其他家族的因子來代替上述重編程因子也可成功進行重編程［4］。基于MYC 家族與多種腫瘤發生發展密切相關，為了臨床使用的安全性，研究者盡量不用c-MYC，僅單獨利用同源域蛋白或OCT4 導入體細胞得到iPSC［5］。

理論上，經過多能性及表觀遺傳學驗證的iPSC在體外能夠向3個胚層多種細胞分化，并且iPSC在體外培養時具有強大的增殖能力，能夠提供研究所需的細胞數量。另外，通過體外誘導iPSC 能夠獲得模擬胃腸道、角膜、皮膚、大腦等的多種類器官，這些類器官具有高度模擬體內組織結構和功能的特性，為研究器官發育和疾病發生提供了細胞模型和動物模型無法替代的工具，具有很好的應用價值。如基于iPSC技術和新型生物材料在體外建立的心臟三維組織模型，能夠模擬心臟早期發育過程［6］。iPSC 因為可以提供大量帶有疾病特征的細胞而成為用于建立藥物篩選模型的最佳選擇。有學者用肌萎縮側索硬化癥患者的細胞制備iPSC，并建立一種運動神經元模型［7］，發現該病的發生與Src/c-Abl通路異常有關，兩種免疫抑制劑西羅莫司和博舒替尼（bosutinib）合用可以在一定程度上恢復肌肉收縮力，減輕患者痛苦。另外，脊髓小腦共濟失調患者的皮膚細胞也可被重編程為iPSC，并將其分化成為“浦肯野細胞”，利用分化的細胞在體外模擬疾病發生過程，發現甲狀腺釋放激素與利魯唑可以阻止疾病發展［8］。由此可見，iPSC不僅解決了構建疾病模型的細胞來源問題，并且能夠為患者提供個體化模型，進而精確分析疾病發生機制，并選擇有效藥物。

此外，利用iPSC 生成移植所需細胞用于再生治療，目前已經進入臨床試驗階段。2017年，日本理化研究所、大阪大學等多團隊合作完成世界首例自體iPSC 來源的色素視網膜移植手術［9］，隨訪25個月未發現異常反應，且移植1年后患者感覺視野較前明亮，光學相干斷層掃描圖像顯示視網膜完整性良好，并具有高密度區域，表明感光細胞在不斷恢復。同時，為了儲存可以應用于臨床的iPSC，全球人群HLA 配型的iPSC 庫也在建設中，一旦成功將加速再生醫學的發展，給無數需要進行移植治療的患者帶來福音。

二、iPSC在皮膚疾病中的應用

1.iPSC 轉化為皮膚：患者來源的iPSC 在細胞和基因治療方面都顯示出顯著優勢。利用iPSC治療皮膚疾病，需要將其有效分化成為皮膚的主要細胞即角質形成細胞和成纖維細胞。2015 年，Gledhill等［10］將正常人來源的iPSC在體外成功定向分化為這兩種細胞以及黑素細胞，為iPSC 應用于皮膚科奠定了基礎。Yang等［11］將iPSC分化成為存在于毛囊隆突部位、影響毛囊生長和循環的上皮干細胞，這些細胞具有生成所有毛囊譜系（包括毛干、內毛根鞘和外毛根鞘）的能力，進而以此重建毛囊的上皮成分和濾泡間表皮。上述由iPSC分化而來的皮膚細胞及附屬器相關細胞可以用于研究和治療傷口愈合和其他退行性皮膚病，并且為脫發提供組織工程學新療法。

Gledhill等［10］在將iPSC成功在體外分化成角質形成細胞和成纖維細胞的基礎上，先開發出基于兩種細胞的三維皮膚等效物，證明iPSC 可以成功為皮膚建模，此后又通過添加iPSC 衍生的黑素細胞增加模型復雜性，并發現黑素可在iPSC 衍生的黑素細胞和角質形成細胞之間轉移。但這種三維皮膚等效物仍存在一定局限性：第一，它尚未進行體內移植，未證明其是否能適應體內環境；第二，這種三維皮膚等效物無法真正模擬人類皮膚復雜性，它們通常包含很少的細胞類型，并且沒有添加皮膚附屬器如毛囊、皮脂腺等。

Kim等［12］將臍帶血單核細胞重編程為iPSC，通過形成擬胚體定向分化為成纖維細胞和角質形成細胞，并利用這兩種細胞構建三維皮膚類器官，最后通過束縛敷料，將三維皮膚類器官移植進入免疫缺陷小鼠皮下，并成功維持2 周。Umegaki-Arao等［13］將大皰性表皮松解癥（EB）患者iPSC分化的角質形成細胞構建的三維皮膚類器官移植到小鼠體內，但并未說明維持時間。Koehler 等［14］早前開發了一種三維鼠源ESC培養模式，可以產生顱表面上皮（一種皮膚表皮的前體組織），在培養過程中，還產生了異質的間充質細胞和神經細胞群；利用此項技術，他們又在體外的三維培養體系中培養鼠源性多能干細胞（包括ESC 和iPSC），建立皮膚類器官，并表明皮膚類器官在模擬正常胚胎毛囊發生過程中可自發地產生新生毛囊［15］。這種皮膚發育的體外模型將有助于研究毛囊誘導機制，評估抑制或促進毛發生長的藥物和模擬皮膚病的發生。2016 年，有學者利用iPSC 制備的三維皮膚器官系統（integumentary organ system，IOS）研發出一種新型體內移植模型［16］，稱為聚類依賴性擬胚體移植方法，他們首先探索出iPSC 移植體內誘導生成各種上皮胚層的培養條件，發現Wnt信號通路可以影響IOS 移植物的毛囊生長數量；將IOS 經過原位移植進入裸鼠后背皮下，證明IOS 具有完整功能性，可以與周圍的宿主組織如表皮、豎脊肌和神經纖維正常連接，且無腫瘤發生，三維IOS 系統中的生物工程毛囊也顯示出正常的毛發生長周期，這項研究利用iPSC初步實現了器官替代療法的目標。

2.iPSC構建皮膚疾病模型：盡管通過活組織體外培養可以得到患者的皮膚細胞用于構建皮膚疾病模型，但這些細胞在體外增殖能力降低，且低齡患兒活組織檢查較難操作。患者來源的iPSC具有無限增殖能力，并可以多向分化，通過基因修正技術還可糾正引起疾病的原位基因突變，因此成為構建皮膚疾病模型的最佳細胞來源，特別是基因變異相關的遺傳性皮膚疾病。

EB是由于編碼皮膚表真皮連接成分的基因突變而造成的一組重癥遺傳性皮膚病，目前沒有十分明確有效的療法。對于重癥EB 患者，表皮再生及修正突變基因十分必要。Umegaki-Arao 等［13］將EB患者皮損來源的iPSC成功分化為角質形成細胞，并在體外建立帶有COL17A1（collagen ⅩⅦalpha-1）基因突變的EB模型；由EB患者非皮損部位的皮膚細胞重編程為iPSC進而分化得來的角質形成細胞并不攜帶基因突變，利用這種細胞制備皮膚等效物并進行小鼠皮膚移植，可為今后EB 移植治療提供新方法［13］。營養不良性EB是由于COL7A1基因突變所致，隱性營養不良型EB（RDEB）是其中病情較為嚴重的表型之一。Itoh 等［17］利用逆轉錄病毒法將RDEB患者來源的成纖維細胞重編程為iPSC，分化為角質形成細胞后建立三維皮膚類似物，成功構建RDEB 疾病的體外模型。另外，Matsumura 等［18］利用非整合性的仙臺病毒載體法將RDEB 患者的角質形成細胞重編程為iPSC，為后續RDEB安全建模提供條件。

外胚層發育不良是一組影響各類外胚層組織（如神經、皮膚等）發生發育的先天性疾病，其中外胚層發育不良性唇裂（ectodermal dysplasia and cleft lip/palate，EEC）由控制表皮發育和維持細胞活動動態平衡的p63基因單點突變引起，EEC綜合征包括皮膚缺陷和角膜緣干細胞缺乏癥。有研究者將攜帶p63 基因結構域中兩位點突變的EEC 患者的成纖維細胞重編程為 iPSC［19］，發現這種 iPSC 可以分化成早期外胚層標志物K18+細胞，但無法進一步分化成K14+細胞（表皮/角膜緣）或K3+/K12+細胞（角膜上皮）；APR-246 是一種能夠恢復突變型p53功能的小化合物，添加APR-246培養后可以使EEC患者來源的iPSC 向角膜上皮細胞分化，并恢復正常的p63相關信號通路，該研究利用EEC患者來源的iPSC 模擬疾病，并為未來EEC 治療藥物篩選鋪平了道路。

3.iPSC 應用于皮膚疾病細胞/基因治療：來自患者的iPSC 攜帶患者自身信息，可以提供治療所需的各種自體細胞類型，在移植治療時不但避免了自身免疫排斥反應，還避開了倫理爭議。Itoh等［17］為了進一步研究RDEB的細胞治療方案，將iPSC分化為真皮成纖維細胞，該細胞可以產生Ⅶ型膠原蛋白，成為具有治療RDEB 的潛力細胞之一。目前EB 的基礎治療研究包括同種異體間充質干細胞（mesenchymal stem/stromal cell，MSC）移植法［20］。MSC是一類基質干細胞的異質群體，可以通過細胞分化和釋放旁分泌因子對傷口愈合起作用，并且MSC能在體內促進Ⅶ型膠原蛋白分泌［21］，但獲取供體骨髓中的MSC 對患者損傷較大，因此可以利用患者來源的iPSC 分化為MSC 進行治療，減少對患者的傷害；Nakayama 等［22］以仙臺病毒為載體將RDEB患者的角質形成細胞重編程為iPSC，將其在體外分化成MSC，然后皮下和靜脈注射至全皮膚損傷的免疫缺陷小鼠體內，2周后觀察到小鼠皮膚出現再上皮化，證明由iPSC 分化而來的MSC 也具有修復傷口的能力。另外，Tolar等［23］發現RDEB患者水皰部位皮膚細胞有編碼Ⅶ型膠原蛋白的COL7A1 基因突變，而無水皰部位皮膚細胞則無突變，他們將無突變的皮膚細胞稱之為自發性基因修正細胞，并重編程為iPSC，再分化成角質形成細胞，以此建立的體外皮膚模型可以正常表達Ⅶ型膠原蛋白，這種方法為在RDEB和其他疾病患者中使用自發性基因修正細胞進行自體細胞治療奠定了基礎。

如前所述，iPSC是可以靶向糾正基因突變的有效工具細胞，這種細胞基因修飾療法為皮膚病的治療提供了新視野。Wenzel等［24］為了證明iPSC可應用于RDEB 的治療，研發出帶有RDEB 疾病特征的COL7A1 基因突變小鼠，獲得其iPSC，再利用Flpo技術將iPSC 進行基因修復，遺傳修復的iPSC 可以分化為功能性成纖維細胞，重新表達并分泌Ⅶ型膠原，移植到RDEB 小鼠體內后通過熒光素追蹤至16周，結果顯示，小鼠表真皮連接處不但恢復了Ⅶ型膠原沉積，還恢復了RDEB小鼠皮膚對起皰的機械抵抗力。幾乎同時，有學者制備RDEB患者經基因校正的角質形成細胞皮膚片用于移植［25］，即利用腺病毒介導的傳統基因組編輯方法靶向修復RDEB 患者來源的 iPSC 的 COL7A1 基因突變，以產生校正的iPSC，由其分化的角質形成細胞異質性較小，并分泌Ⅶ型膠原，在體外類器官培養和小鼠移植實驗中都能形成分層表皮。此后，Shinkuma等［26］改進基因編輯方法，利用內轉錄激活因子效應物核酸酶和成簇的規律間隔的短回文重復序列（CRISPR）/CRISPR 相關蛋白9技術，對顯性營養不良性EB 患者來源的iPSC 進行基因編輯，經過分選，90%的iPSC被成功編輯，這些iPSC可以分化成分泌Ⅶ型膠原蛋白的角質形成細胞和成纖維細胞，這項研究通過iPSC證實突變位點特異性基因組編輯在顯性失活疾病中運用的可行性。

三、小結與展望

目前，iPSC技術在細胞替代療法和基因靶向治療等方面都表現突出，但將iPSC 衍生的皮膚細胞應用于臨床，還面臨著幾個重要的問題，即①治療有效性：這意味著不但要獲得大批高質量可供移植的細胞，并且這些細胞還要耐受移植環境，可以應對應激、衰老等情況而維持持久的功能性，這些都需要進一步對iPSC 來源的移植細胞進行驗證；②基因穩定性：2014 年有日本學者將由iPSC 來源的視網膜色素上皮細胞移植給黃斑變性患者［27］，但由于移植細胞中有2個微小基因突變，臨床試驗被叫停，如何維持分化細胞的基因穩定性是將iPSC技術應用于臨床的關鍵；③免疫原性：iPSC 技術要被大規模應用于臨床，就需要建立同種異體的iPSC庫，如前文所述這項工作已在進行中，在這種情況下，降低異體細胞的免疫原性，精確地進行HLA配型就顯得十分重要。此外，對于iPSC 存在形成腫瘤風險的質疑從未消失，但iPSC 在分化過程中干性基因相繼沉默，目的細胞的特征性基因上調，細胞命運發生改變，從目前的臨床移植試驗來看，iPSC分化的細胞并無形成腫瘤的風險。

盡管面臨困難，但iPSC 憑借其獨特優勢依然給皮膚疾病的治療和研究帶來深遠影響。目前iPSC 技術顯然已成為遺傳性皮膚病的一種新型靶基因治療工具。另外，iPSC分化細胞若能保持基因穩定性，針對一些重度燒傷或瘢痕疙瘩等無法從健康區域大量擴增表皮細胞的患者，也將具有很大的移植優勢。總之，iPSC技術將加速再生醫學在皮膚疾病中的應用，為皮膚再生醫學的發展作出貢獻。

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