重組IL-12對人乳腺癌細胞自噬的研究

林艷 林倩 劉婷莉 馬玉華 何春容 梁樹梅 周明莉

摘要：目的? 探討重組人IL-12（rIL-12）對乳腺癌細胞自噬的影響。方法? 兩株乳腺癌細胞（MDA-MB-231和MCF7）分別用rIL-12處理，經免疫蛋白印跡技術和細胞免疫熒光技術檢測其自噬微管相關蛋白輕鏈3（LC3）的變化，以觀察自噬情況;另外，用透射電鏡觀察rIL-12處理乳腺癌細胞前后自噬小體的變化。分別用胰島素樣生長因子1（IGF-1）激活磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）通路，再加入rIL-12處理后，蛋白免疫印跡法檢測相關通路蛋白PI3K/Akt， 哺乳動物雷帕霉素靶點（TOR）磷酸化變化及LC3的表達。結果? 與空白組相比，rIL-12組細胞的自噬標志蛋白LC3表達增高，差異有統計學意義（P<0.05），且增加程度呈時間和濃度依賴性;熒光顯微鏡觀察自噬體形成的結果顯示，與空白組相比，rIL-12處理組的細胞核周點狀聚集的綠色熒光增多;使用電鏡觀察到rIL-12處理組明顯有自噬小體形成。與rIL-12組相比，IGF-1+rIL-12組的LC3Ⅱ表達減少，差異有統計學意義（P<0.05）。結論? rIL-12可以激活乳腺癌細胞自噬，并通過抑制PI3K/Akt信號通路的機制，促進自噬標志蛋白LC3，特別是LC3Ⅱ的表達。

關鍵詞：自噬;乳腺腫瘤;重組人IL-12;PI3K/Akt通路

中圖分類號：R737.9? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標識碼：A? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2019.23.018

文章編號：1006-1959（2019）23-0064-06

Study on Autophagy of Human Breast Cancer Cells by Recombinant IL-12

LIN Yan，LIN Qian，LIU Ting-li，MA Yu-hua，HE Chun-rong，LIANG Shu-mei，ZHOU Ming-li

（Department of Clinical Medical Laboratory，Chengdu Third People's Hospital，Chengdu 610031，Sichuan，China）

Abstract：Objective? To investigate the effect of recombinant human IL-12 （rIL-12） on breast cancer cell autophagy. Methods? Two breast cancer cells （MDA-MB-231 and MCF7） were treated with rIL-12， and the changes of autophagy microtubule-associated protein light chain 3 （LC3） were detected by immunoblotting and cell immunofluorescence. Observe autophagy; in addition， observe the change of autophagosomes in breast cancer cells before and after treatment with rIL-12 using transmission electron microscopy. Insulin-like growth factor 1 （IGF-1） was used to activate the phosphatidylinositol-3 kinase / protein kinase B （PI3K / Akt） pathway， and then treated with rIL-12. Western blot was used to detect the related pathway protein PI3K / Akt ， Mammalian rapamycin target （TOR） phosphorylation changes and LC3 expression. Results? Compared with the blank group， the expression of autophagy marker protein LC3 in the cells of the rIL-12 group was significantly increased， the difference was statistically significant （P<0.05）， and the degree of increase was time- and concentration-dependent; The results showed that， compared with the blank group， the green fluorescence around the nucleus in the rIL-12 treated group was significantly increased; it was observed that the autophagic bodies were formed in the rIL-12 treated group. Compared with rIL-12 group， the expression of LC3Ⅱ in IGF-1 + rIL-12 group was significantly reduced，the difference was statistically significant （P<0.05）. Conclusion? rIL-12 can activate the autophagy of breast cancer cells， and promote the expression of autophagy marker protein LC3， especially LC3Ⅱ through the mechanism of inhibiting PI3K / Akt signaling pathway.

Key words：Autophagy;Breast tumor;Recombinant human IL-12;PI3K/ Akt pathway

乳腺癌（breast carcinoma）是導致世界女性因癌癥死亡的重要原因[1]。在乳腺癌患者中，近50%的病例和60%的死亡率發生在發展中國家[2]。自噬是一種通過溶酶體來降解受損細胞器以及錯誤折疊的蛋白質的自我消化機制[3]，在合成、降解和大分子與細胞器的循環之間保持平衡。自噬被認為具有抑制腫瘤和促進腫瘤生長的功能[4，5]，這可能和不同的腫瘤類型和發展階段有關[6，7]。在對乳腺癌細胞的研究中發現，自噬能夠抑制腫瘤的發生，自噬標記基因 beclin 1的過表達會抑制乳腺癌細胞的生長[8]，40%～75%的人乳腺癌細胞、卵巢癌和前列腺癌細胞存在beclin 1缺陷[9，10]。在體內外實驗中，beclin 1能夠抑制腫瘤細胞增殖和腫瘤形成[11]，許多抗癌藥物，包括他莫西芬、雷帕霉素、三氧化二砷和組蛋白去乙酰化酶抑制劑會導致細胞因自噬而死亡。因此，激活自噬可能是抑制乳腺癌細胞發生的重要方式。先前研究已經證實了IL-12的抗腫瘤效應[12]。IL-12 通過活化大量T細胞、巨噬細胞、樹突細胞來抑制腫瘤細胞生長[13]，通過抑制血管的生長來減少營養和氧的供給，從而抑制腫瘤細胞生長[14]，能夠刺激或抑制腫瘤細胞分泌腫瘤相關細胞因子。有研究表明IL-12能夠通過上調巨噬細胞集落刺激因子1受體的表達和磷酸化誘導單細胞腫瘤細胞向巨噬細胞樣細胞極化[15]。然而，IL-12的抗腫瘤作用機制仍有待闡明。此外，IL-12對腫瘤細胞自噬的影響及其機制的報道較少。本文探討了IL-12誘導人乳腺癌細胞自噬的可能信號通路，旨在為IL-12介導的抗腫瘤作用機制提供新的參考。

1材料與方法

1.1細胞及試劑? 人乳腺癌細胞株MDA-MB-231和MCF-7細胞來源于ATCC;DMEM高糖培養基購自美國Hyclone公司;胎牛血清購自杭州四季青公司;人重組IL-12購自美國peprotech公司;重組人IGF-1細胞因子購自美國R&D公司;兔抗人LC3A/B抗體購自美國NOVUS公司;兔抗人p-Akt（473）/Akt抗體和兔抗人p-mTOR /mTOR均購自美國CST公司;兔抗人多克隆β-actin抗體購自美國Immunoway公司;辣根過氧化物酶（horseradishperoxidase，HRP） 標記的羊抗兔 IgG（二抗）和FITC標記的羊抗兔二抗均購自北京中杉金橋生物技術有限公司;SDS-PAGE及免疫熒光相關試劑購自上海碧云天生物技術有限公司;化學發光試劑購自德國Merck Millipore 公司;熒光顯微鏡來自日本Nikon Corporation。

1.2細胞培養? 乳腺癌細胞MDA-MB-231和MCF-7細胞均分別用含10%胎牛血清的DMEM高糖完全培養液培養，含100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素。當細胞融合率約80%時， 用0.25%胰酶消化并傳代，置于37℃、CO2體積分數為5%的細胞培養? 箱中培養。將MDA-MB-231和MCF-7細胞（約1×106/孔）接種于6孔板，待其在6孔板中長到約60%融合時，開始實驗處理。

1.3實驗處理分組? ①將MDA-MB-231和MCF-7細胞分為空白組（B）、rIL-12組（1、2、3、5、12）、陽性對照組（P），其中rIL-12組，分別用5 ng/ml的rIL-12培養1， 2， 3， 6， 12 和 24 h。另外另將細胞分? ? 為空白組（B）、rIL-12組分別用0.1， 0.5， 1， 5， 10 和 20 ng/ml的rIL-12培養乳腺癌細胞12 h，Western blot檢測細胞內LC3蛋白，特別是LC3Ⅱ的表達情況。②將細胞分為空白組，rIL-12組和陽性對照組，rIL-12組用5 ng/ml的rIL-12培養人乳腺癌細胞24 h后，在熒光顯微鏡下觀察細胞LC3的表達情況。③將細胞分為空白組，rIL-12組，rIL-12組用? 5 ng/ml的rIL-12 培養乳腺癌細胞12 h，用透射電子顯微鏡觀察空白組和rIL-12自噬小體。④Akt通路實驗：包括rIL-12+IGF-1組和IL-12 組。rIL-12+IGF-1組：先用 100 ng/ml的IGF-1 培養 2 h，再加入 5 ng/ml的rIL-12 培養 4 h。IL-12 組：5 ng/ml的rIL-12培養4 h。⑤本實驗所有的空白組（圖中分組表示為B）為10%胎牛血清培養基，陽性對照組（圖中分組表示為P）為含1%胎牛血清的DMEM高糖培養基饑餓3 h 。

1.4蛋白免疫印跡分析? 實驗完成后，收集6孔板中MDA-MB-231和MCF-7細胞，提取總蛋白，經SDS-PAGE分離蛋白后，濕轉至0.45 μm 的PVDF膜，5%小牛血清封閉1 h，分別加入一抗，LC3，p-mTOR/mTOR，p-Akt（473）/Akt抗體的稀釋比例均為1∶1000;β-actin的稀釋比例為1∶2000），4℃過夜;用TBST洗膜，加入二抗（稀釋比例為1∶1000），37℃反應2 h;用TBST洗膜后按照電化學發光試劑盒說明進行顯影。采用Quantity One 4.5.2軟件對各組電泳條帶進行灰度值分析，以其與內參β-actin條帶灰度值的比值來評估各相關分子的蛋白相對表達水平。

1.5免疫熒光? 在24孔培養板中置入8×8 mm的滅菌爬片，再加入MDA-MB-231和 MCF-7 兩株乳腺癌細胞懸液（約2×105/孔），當其生長約60%融合時，開始實驗組處理。實驗處理完畢后用預冷的PBS洗3次，用4%的多聚甲醛室溫固定20 min后再次用預冷PBS洗3次。爬片用0.1%的Triton透膜15 min后，預冷PBS洗3次。10%山羊血清（PBS稀釋）室溫封閉30min。之后加入LC3一抗4℃ 孵育過夜（LC3一抗用10% 山羊血清1∶200稀釋），洗滌后用FITC標記的羊抗兔二抗（山羊血清1∶200稀釋）室溫避光孵育2 h。再次洗滌后，用10% 用PBS稀釋的4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（4'，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）室溫孵育5 min，洗滌3次后用甘油封片4℃避光保存，在熒光顯微鏡野下（×800）觀察LC3綠色熒光點表達。

1.6透射電子顯微鏡? MDA-MB-231和MCF-7 兩株乳腺癌細胞用濃度為rIL-12（5 ng/ml）的10%胎牛血清的DMEM高糖完全培養液培養12 h后用預冷PBS洗3次，用0.1%胰蛋白酶消化收集細胞，用4℃離心機1，500 xg 離心10 min，棄去微量離心管上清液，沿管壁加入1.5 ml的2.5% 戊二醛放于4℃固定至少2 h。及時送重慶醫科大學生命科學院電鏡室進行制樣和拍片（×30000）。

1.7統計學方法? 應用SPSS 19.0軟件對各實驗結果數據進行統計學分析，各實驗均獨立重復3次統計結果，數據以（x±s）表示，多組間差異采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1 Western blot檢測rIL-12與人乳腺癌細胞中LC3蛋白的表達關系? Western blot結果顯示，rIL-12能夠增加人乳腺癌細胞中LC3蛋白表達，經rIL-12組的乳腺癌細胞相對空白組中的自噬標記蛋白LC3表達增加，特別是LC3Ⅱ的表達，且呈時間和劑量的依賴性，見圖1A、1B。

2.2 免疫熒光檢測rIL-12與人乳腺癌細胞中LC3蛋白表達關系? 免疫熒光結果顯示，rIL-12能夠增加人乳腺癌細胞中LC3蛋白表達與空白組相比，陽性對照組和rIL-12組LC3Ⅱ蛋白的表達增加，在顯微鏡下表現，rIL-12組的細胞核周圍聚集的顆粒狀綠色熒光增加，見圖2。

2.3 rIL-12與乳腺癌細胞自噬小體形成的關系? 透射電子顯微鏡結果顯示，rIL-12能夠增加人乳腺癌細胞自噬小體形成，經rIL-12處理后的乳腺癌細胞中發現許多自噬小體（黑色箭頭），空白對照組乳腺癌細胞不易找到自噬小體，見圖3。

2.4 rIL-12通過抑制Akt通路誘導乳腺癌細胞自噬 Western blot和免疫熒光結果顯示，與rIL-12組相比，IGF-1+rIL-12組的p-PI3K/Akt增加，p-mTOR表達也增加， LC3Ⅱ表達明顯減少，見圖4、圖5。說明Akt的活化能夠抑制rIL-12誘導乳腺癌細胞? ?p-mTOR，從而抑制LC3特別是LC3Ⅱ表達的能力，提示rIL-12能通過抑制PI3K/Akt來抑制下游的mTOR磷酸化來誘導乳腺癌細胞的自噬。

（29）：3303-3308.

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收稿日期：2019-9-2;修回日期：2019-9-14

編輯/肖婷婷