粳稻02428突變體RIL孕穗期耐冷性狀與糙米功能成分的遺傳分析

謝勇武，曾亞文，譚屬瓊

（1.福建師范大學 閩南科技學院，福建 泉州 362332；2.云南省農業科學院 生物技術與種質資源研究所）

黃酮、γ-氨基丁酸（GABA）及抗性淀粉（RS）是重要的次生代謝物質。稻米黃酮類化合物中研究較多的花色苷類物質，具有抗癌、益智、抗氧化、降低血清膽固醇和血清脂質等功效；GABA是谷氨酸脫羧酶轉化的產物，在人體代謝中起著重要作用；RS具有熱量低及功能多等特點，常常作為食品的基料，可有效控制糖尿病情，減少熱量的攝取和有效控制體重。冷害是水稻減產的重要原因，水稻各生育時期耐冷性在種間、種質之間存在差異。通常情況下，低溫下植株的代謝變慢，植株產生的次生代謝產物黃酮、GABA及RS等功能成分的量有所不同。GABA在植物體內積累與代謝機制與質膜上的轉運蛋白密切相關，這與水稻耐冷存在一定關系。育種實踐中，農藝性狀是水稻育種的重要指標。本研究對粳稻02428突變體RIL F6家系群糙米RS、GABA、總黃酮含量的遺傳規律進行分析。同時，利用通徑和逐步回歸分析對各功能物質含量與主要農藝性狀進行相關分析，為冷害條件下選育高生物活性成分含量水稻提供參考，也為水稻耐冷選育提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 材料

重組自交系群體構建方法：

1.2 方法

將親本及其F6代種植于云南省農業科學院試驗場（昆明海拔1 916 m，7月22-27日每天14：00實測溫度20.2～13.8℃，自然冷害）。3月25日播種、5月12日移栽。隨機區組設計，2次重復；插秧規格20 cm×10 cm，單本栽插，1行區，每行11株，常規栽培管理。成熟后，按《稻種資源觀察調查項目及記載標準》調查株高、穗頸長、穗下節長、劍葉長、劍葉寬、穗長、1～2節長、實粒數、秕粒數、結實率。每小區全部調查，以其平均值作為統計單位進行考種。

1.3 測定項目和方法

1.3.1 總黃酮含量測定

采用硝酸鋁絡合比色法測定總黃酮含量。準確稱取糙米樣品(500 ± 1) mg于10 mL帶蓋離心管中，每管加5 mL 50%乙醇，置于振蕩器上（200次/min）振蕩 1 h。取上清液于另一離心管，5 000 r/min離心3 min，離心之后取1 mL上清液于25 mL的容量瓶中，加0.6 mL 5% 亞硝酸鈉，混勻后靜置5 min；加0.6 mL 10%的硝酸鋁，混勻后靜置6 min；加4 mL 5% 氫氧化鈉，混勻后靜置10 min，在波長500 nm處測定吸光值。從Sigma公司購買的蘆丁標準樣品濃度（2、3、4、5、6、7 mg/mL）與其吸光度之間呈良好的線性關系：y=1 512.4x-24.828，相關系數R2=0.999。說明測定方法可行，準確性高、結果穩定。

1.3.2 GABA含量測定

采用比色法測定GABA的含量。準確稱取糙米樣品（500 ± 1） mg于10 mL帶蓋離心管中，每管加5 mL蒸餾水，置于振蕩器上（200次/min）振蕩 4 h。取上清液于另一離心管，10 000 r/min離心3 min，離心之后取1 mL上清液于25 mL的容量瓶中，加0.2 mol/L（pH9.0）硼酸鹽緩沖液0.6 mL、5%苯酚溶液2 mL、7%次氯酸鈉溶液2 mL，搖勻后放入沸水浴加熱5 min，直到顏色變成黃綠色，取出冰浴5 min，待溫度升至室溫，于645 nm處測定溶液的吸光度。從Sigma公司購買的GABA標準樣品濃度（0.05、0.1、0.15、0.2、0.25 mg/mL）與其吸光值具有良好的線性關系： y=44.361x-1.457，相關系數為R2=0.998。說明測定方法可行，準確性高、結果穩定。

1.3.3 RS含量測定

采用Go?i法測定RS含量。稱取（100 ±1）mg樣品于10 mL帶蓋離心試管底部，每管內加胰α-淀粉酶反應液4.0 mL（3 000 U/mL），放入37 ℃的水浴恒溫振蕩器中（200次/min）水解，16 h后取出。加4.0 mL 95%乙醇后在離心機上于5 000 r/min離心5 min，棄上清液，向剩下的沉淀中加4.0 mL醋酸鈉緩沖溶液（pH3.8）搖勻，加入1 000 μL 葡萄糖糖化酶液（3 000 U/mL），放入50 ℃水浴恒溫振蕩器中（200次/min），30 min后取出。3 000 r/min離心2 min，吸取上清液2.0 mL于25 mL容量瓶，加5%苯酚溶液1.0 mL，混勻后迅速滴加濃硫酸7 mL，搖勻室溫放置5 min，然后置冷水中冷卻10 min，在485 nm波長處測定吸光值。以加蒸餾水代替水解液制作空白，以0.3%、0.6%、0.9%、1.2%、1.5%分析純蔗糖梯度溶液作標準直線，硫酸苯酚法顯色，標樣試驗重復進行3次，求得其回歸方程為： y=1.625 x-0.022，相關系數R2=0.994 8，具有良好的線性關系，說明測定方法可行，準確性高、結果穩定。

1.4 數據分析

選擇2組平行變數水稻糙米GABA和總黃酮含量與農藝性狀。再以農藝性狀作為自變量（Qi），把水稻糙米GABA和總黃酮含量作為因變量（R^），采用統計軟件SPSS 19進行通徑和逐步回歸分析。

2 結果與分析

2.1 RS、總黃酮、GABA含量及其分布

群體F6代RS、總黃酮、GABA含量為RS（6 462 mg/kg）＞ 總黃酮（697.4 mg/kg）＞ GABA（232.6 mg/kg），其中總黃酮和GABA的偏度和峰度絕對值均＜1.96，呈正態分布，而RS的偏度和峰度絕對值均＞1.96，呈偏態分布，GABA和總黃酮含量在一定范圍內變化具有連續性，且各株系間變化幅度較大，說明水稻GABA和總黃酮含量受數量性狀控制，是一種數量性狀（圖1）。

圖1 F6代RS、GABA和總黃酮含量正態分布圖

2.2 RS、總黃酮、GABA與耐冷指標的相關性

由表1可知，F5和F6代中GABA含量與實粒數、秕粒數、總粒數、結實率4個耐冷指標都達到顯著或極顯著相關水平，而無論是F5還是F6代，RS含量都與實粒數、秕粒數、總粒數、結實率4個耐冷指標無明顯相關性。

表1 F5和F6代耐冷指標與RS、總黃酮、GABA的相關性

2.3 親本和RIL群體RS、總黃酮、GABA含量遺傳分析

對親本和RIL群體RS、總黃酮、GABA含量進行遺傳分析可知，GABA和總黃酮含量存在較大的遺傳變異差異。GABA含量在RIL群體平均值為678 mg/kg，明顯低于兩親本，總黃酮含量在RIL群體平均值為191 mg/kg，高于兩親本。GABA和總黃酮含量遺傳變異系數分別為20.61%和54.73%，遺傳變異范圍分別為0.415%～1.904%和0.053%～0.81%。所以RIL群體中GABA和總黃酮含量遺傳變異差異較大，在育種中選育高GABA和總黃酮含量品種時選擇空間較大，具有巨大的遺傳潛力。

表2 親本和RIL群體GABA和總黃酮含量遺傳分析

2.4 主要農藝性狀與GABA含量遺傳通徑分析

對糙米主要農藝性狀和GABA含量進行遺傳通徑分析，見表3。在主要農藝性狀中只有穗長、穗下節長和實粒數的直接通徑系數為正值，與GABA含量成正相關，促進GABA含量的升高，其余直接通徑系數均為負值，與GABA含量成負相關。對糙米GABA含量影響最大的是秕粒數，結實率次之。間接通徑分析中，穗下節長和實粒數的間接通徑系數為負值，其余的各主要農藝性狀間接通徑系數為正值。此外，直接通徑系數小于間接通徑系數的農藝性狀有劍葉寬和結實率，說明劍葉寬和結實率對GABA含量的影響與其他農藝性狀的間接作用有關，其中影響劍葉寬對GABA含量間接作用最大的是實粒數（0.051 4），影響結實率對GABA含量間接作用最大的是秕粒數（0.241 5）。

表3 主要農藝性狀與GABA含量遺傳通徑分析

2.5 主要農藝性狀與總黃酮含量遺傳通徑分析

對糙米主要農藝性狀和總黃酮含量進行遺傳通徑分析，見表4。在主要農藝性狀中劍葉長、株高、實粒數和穗頸長的直接通徑系數為負值，與總黃酮含量成負相關，限制總黃酮含量的升高，其余直接通徑系數均為正值，與總黃酮含量成正相關。對糙米總黃酮含量影響最大的是實粒數，秕粒數次之。間接通徑分析中，結實率、秕粒數、穗下節長和穗長的間接通徑系數為負值，其余的各主要農藝性狀間接通徑系數為正值。此外，直接通徑系數小于間接通徑系數的農藝性狀有劍葉長和結實率，說明劍葉長和結實率對總黃酮含量的影響與其他農藝性狀的間接作用有關，其中影響劍葉長對總黃酮含量間接作用最大的是穗下節長（0.148 3），影響結實率對總黃酮含量間接作用最大的是秕粒數（-0.226 8）。

表4 主要農藝性狀與糙米總黃酮含量遺傳通徑分析

2.6 主要農藝性狀對糙米GABA含量和總黃酮含量的逐步回歸分析

把主要農藝性狀對糙米GABA含量和總黃酮含量進行逐步回歸分析，以株高（Q1）、劍葉長（Q2）、劍葉寬（Q3）、穗頸長（Q4）、穗下節長（Q5）、1～2節長（Q6）、穗長（Q7）、實粒數（Q8）、秕粒數（Q9）和結實率（Q10）為自變量，以糙米GABA含量和總黃酮含量為因變量（R^），分別進行逐步回歸分析，建立回歸方程。建立方程時，以自變量對因變量作用大小選擇回歸方程初始參數。方程中無顯著變量可引入（F≥0.05），也無顯著的變量可剔除（F≥0.01）。得出公式如下：

以上公式中，GABA的含量和總黃酮的含量多元相關系數分別為R=0.999 95和R=0.999 97，經檢驗均達到了極顯著水平。分析表明，GABA的含量主要受結實率（Q10）的影響，而糙米總黃酮的含量受劍葉寬（Q3）和實粒數（Q8）兩者影響，線性關系達到顯著或極顯著。

3 結論與討論

本研究對糙米RS、GABA和總黃酮含量進行了遺傳分析，其受到不同的性狀影響，同一植物的不同部位之間存在明顯差異。有學者對發芽糙米中GABA含量進行測定，發現發芽糙米GABA含量為普通糙米的7倍左右，可達0.428 1 mg/g。突變體RIL群里糙米GABA和總黃酮含量都存在豐富的變異，其GABA含量在0.415%～1.904%，平均值為0.678%、變異系數為20.61%；總黃酮含量在0.053%～0.81%，平均值為0.191%、變異系數為54.73%。在實際育種中選出高GABA和總黃酮含量的株系在理論上具有可行性。同時，研究還發現GABA和總黃酮含量在一定范圍內變化具有連續性，且各株系間變化幅度較大，說明水稻GABA和總黃酮含量受數量性狀控制，是一種數量性狀，可為GABA和總黃酮QTL定位提供參考。

通過通徑分析發現，秕粒數對糙米GABA含量影響最大，結實率次之；實粒數對糙米總黃酮含量影響最大，秕粒數次之。與糙米GABA含量直接通徑系數為正值的農藝性狀有穗長、穗下節長和實粒數，其他為負值；與糙米總黃酮含量直接通徑系數為負值的農藝性狀有劍葉長、株高、實粒數和穗頸長，其他為正值。這表明農藝性狀中的秕粒數、實粒數和結實率可為選育高GABA和總黃酮水稻提供參考依據。

通過逐步回歸方程分析得到了突變體RIL糙米GABA的含量主要受結實率的影響；而糙米總黃酮的含量受劍葉寬和實粒數影響，并且線性關系達到顯著或極顯著。因此，在選育生產中可借助回歸方程指導功能型水稻選育。