常壓室溫等離子體(ARTP)誘變選育高核酸釀酒酵母

李小坤，王旺，林影，梁書利

（華南理工大學生物科學與工程學院，廣東廣州 510006）

核糖核酸(Ribonucleicacid，RNA)是一類重要的生物大分子，它不僅在基因的表達和蛋白質的生物合成中起著關鍵的作用，而且還能促進細胞的諸多生理功能[1]。核糖核酸降解后得到的核苷酸、核苷及堿基用途廣泛。5’-核苷酸可作為增味劑應用于食品工業，而它主要來源是 RNA[2,3]。目前，絕大部分生產核糖核酸的企業是利用經誘變篩選后的產朊假絲酵母或熱帶假絲酵母等發酵提取得到核糖核酸[4]。解脂假絲酵母為念珠菌的一種，念珠菌是引起全身性念珠菌感染的主要致病原，至今為止仍不能完全說明假絲酵母對人畜健康無害。而釀酒酵母是最早人類認識和利用微生物之一，幾個世紀以來，釀酒酵母被用于食品和酒精飲料生產[5]。

應用常壓室溫等離子體（ARTP）技術進行誘變育種[6]。等離子體（Plasma）是與物質的固態、液態和氣態并存的物質第四態，是一種正離子和電子密度大致相等的電離氣體，具有導電、發光、化學性質活潑以及分布廣等特點[7]。均勻的等離子體射流作用于細胞，可引發種類豐富的DNA損傷，獲得大量突變庫[8]。到目前為止，ARTP誘變育種儀已經成功應用于包括細菌、真菌、微藻在內的多種微生物，并且突變率和正突變率均較高，突變株遺傳穩定性好等諸多優點[9]。

本研究以從環境中分離得到的菌株 Y17作為出發菌株，對其進行反復多次ARTP等離子誘變，利用氯化鉀敏感篩選得到核酸含量提高的突變菌株Y17aM3，然后對突變菌株進行生理生化特性分析，并進行發酵培養條件優化及傳代穩定性分析。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

野生釀酒酵母釀酒酵母Y17均由廣東江門生物技術開發中心有限公司提供。

1.1.2 培養基與溶液

麥芽汁培養基：購買于廣東環凱微生物科技有限公司，稱取130.1 g產品溶解于1000 mL蒸餾水中，攪拌至完全溶解，115 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

麥氏培養基：葡萄糖 0.1%、KCl 0.18%、NaAC 0.82%、酵母浸膏0.25%、瓊脂2%，115 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

碳源同化試驗基礎培養基：(NH4)2SO40.5%、KH2PO40.1%、MgSO40.05%、CaCl20.01%、NaCl 0.01%、酵母浸膏0.02%、糖或其它碳源2%，115 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

氮源同化試驗基礎培養基：葡萄糖2%、KH2PO40.1%、MgSO40.05%、酵母浸膏0.02%，115 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

糖蜜酸化液：80 g糖蜜加120 mL蒸餾水攪拌均勻，用硫酸調節pH 4.0～4.3，90～95 ℃水浴并不斷攪拌15 min，4000 r/min離心10 min，取上清。

糖蜜培養基：上述糖蜜酸化液加水至1000 mL，加3%營養液并調pH至4.8，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

營養液：85%磷酸 4.55%、硫酸銨 25%、尿素12.5%、硫酸鎂1.25%。

1.2 儀器與設備

購于江蘇無錫源清天木生物科技有限公司的ARTP誘變育種儀；UV-5200型紫外可見分光光度計。

1.3 實驗方法

1.3.1 培養條件

1.3.1.1 菌種活化

用無菌牙簽從保種管中蘸取菌液于麥芽汁平板上劃線，在30 ℃培養箱培養2～3 d。

1.3.1.2 搖瓶種子培養

從麥芽汁平板上挑取單菌落接種于裝有10 mL麥芽汁培養基的 50 mL三角瓶中，在柜式旋轉搖床上30 ℃，250 r/min培養24 h。

1.3.1.3 搖瓶發酵培養

按5%的接種量將種子液轉接于裝有100 mL糖蜜培養基的 500 mL三角瓶中，在柜式旋轉搖床上30 ℃，250 r/min培養18 h。

1.3.2 RNA含量測定方法

收集并洗凈發酵培養后的釀酒酵母，稱取一定重量菌體，采用高氯酸法[2,10]測定RNA含量。RNA含量的計算公式如下：

式中：OD260是紫外可見分光光度計于260 nm測得的吸光值，W干重是樣品的干重。

1.3.3 釀酒酵母單倍體分離

釀酒酵母在麥芽汁培養基中經二級活化后于麥氏培養基平板上劃線，28 ℃培養。每天進行子囊孢子染色并鏡檢，觀察釀酒酵母產孢情況[11]。產孢率較高時（5～7 d左右），采用文獻[12]進行釀酒酵母單倍體分離。將單倍體分離后得到的菌液適當稀釋，涂布于麥芽汁培養基平板上，28 ℃培養2～3 d，最后PCR鑒定單倍體菌株[13]。

1.3.4 ARTP誘變育種

參考文獻[14,15]進行ARTP誘變育種，分別設定了菌懸液誘變的處理時間為0、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70 s，統計不同處理時間下菌株的致死率。致死率計算公式如下：

式中：T是樣品在未經ARTP處理時的總菌落數，A是樣品在ARTP處理后存活的的菌落數。

1.3.5 篩選方法

采用KCl敏感篩選高核酸突變菌株[16]。誘變處理后培養2～3 d，影印到含一定濃度KCl的麥芽汁培養基平板，篩選出對KCl敏感的突變株，搖瓶發酵培養并測定RNA含量。

1.3.6 生理生化特性

參考文獻[17]進行釀酒酵母培養特征和細胞形態觀察、碳源同化試驗、氮源同化試驗、耐糖性、耐酸性以及耐鹽性等一系列生理生化特性分析。

1.3.7 發酵培養優化

參考文獻[18]進行釀酒酵母培養條件和培養基成分進行優化，包括接種量、初始pH、培養溫度、氮源和無機鹽，確定最適的培養條件以及培養基成分。

1.3.8 傳代試驗

參照文獻[19]進行傳代試驗，將釀酒酵母突變菌株Y17aM3連續傳代培養至10代。

1.3.9 數據統計分析

對研究過程中所得到的數據進行統計分析，本研究所采用的統計量為標準差[20]。標準差是是各數據偏離平均數的距離的平均數，是離均差平方和平均后的方根，用公式表示為：

式中：數值 X1，X2，X3……XN(皆為實數)，其算術平均值為μ，標準差為σ。

2 結果與討論

2.1 釀酒酵母單倍體分離

用光學顯微鏡觀察釀酒酵母產孢情況結果如圖1，圖中綠色的為子囊孢子，紅色的為營養細胞。由圖可看出細胞形成子囊孢子的數量并不都相同，其中形成2個和3個子囊孢子相對較多，能形成4個子囊孢子非常少。

圖1 釀酒酵母Y17的子囊孢子Fig.1 The ascospores of Saccharomyces cerevisiae Y17

圖2 釀酒酵母Y17單倍體配型PCR鑒定Fig.2 Identification of the haploid types of Saccharomyces cerevisiae Y17 by PCR

釀酒酵母的交配型是由位于酵母染色體Ⅲ上MAT座控制的，MAT座上的兩個等位基因MATa和MATα大約相差100 bp[21]。PCR產物僅有一條544 bp條帶的為a型單倍體，PCR產物僅有一條404 bp條帶的為α型單倍體，兩條產物都有的為二倍體[22]。如圖2，得到4株Y17a型單倍體，3株Y17α型單倍體。兩種交配型單倍體分別挑取3株與原始出發菌株Y17同時培養測定RNA含量，結果如圖3。兩種配型單倍體RNA含量分配不均，a型單倍體RNA含量比α型單倍體約高50%。

圖3 釀酒酵母Y17單倍體RNA含量Fig.3 The RNA content of haploid of Saccharomyces cerevisiae Y17

2.2 ARTP誘變育種

以RNA含量最高的a型單倍體為出發菌株進行ARTP誘變，致死率和誘變處理時間關系如圖 4。選擇誘變效應最強即致死率90%～95%的55 s進行反復誘變[23]，最終得到一株RNA含量比原始出發菌株Y17高39%突變菌株Y17aM3（如圖5）。將Y17aM3在糖蜜培養基中培養，從第6 h開始每隔2 h取一次樣，得到Y17aM3生長及產RNA曲線如圖6。由圖6可知，發酵培養至12 h之前，酵母生長和RNA含量都隨著培養時間增加而增加；12～18 h酵母生長處于穩定期，而RNA含量在18 h時最高；18 h之后，酵母生長處于衰亡期，RNA含量隨著培養時間增加而降低。

圖4 致死率和誘變處理時間關系Fig.4 The relationship between lethality rate and time of mutagenesis

圖5 突變菌株RNA含量Fig.5 The RNA content of Mutant strains

圖6 突變菌株Y17aM3生長及生產RNA曲線Fig.6 The growth and RNA production of mutant strain Y17aM3

2.3 釀酒酵母生理生化實驗

2.3.1 形態特征

將Y17aM3和Y17進行培養并誘導產孢，觀察菌落形態和培養特征，并在油鏡下觀察細胞形態和產孢情況。結果如圖7和表1。Y17aM3和Y17細胞形態均為檸檬形，菌落均為乳白色、有光澤、邊緣整齊，無性繁殖方式均為出芽生殖，液體培養均產生白色沉淀。Y17aM3為單倍體，不能產生子囊孢子。Y17aM3的形態特征與Y17一致，符合釀酒酵母基本形態特征。

圖7 釀酒酵母的形態特征觀察Fig.7 Observation on the morphological characteristics of Saccharomyces cerevisiae

表1 釀酒酵母形態特征Table 1 Morphological characteristics of Y17aM3

表 2釀酒酵母糖發酵結果Table 2 The results of Saccharomyces cerevisiae to ferment sugars

2.3.2 糖發酵試驗

對Y17aM3和Y17進行糖發酵試驗，Y17W和Y17aM3均能夠發酵葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、果糖、半乳糖、可溶性淀粉、棉子糖，均不能夠發酵糊精、木糖、木聚糖、乳糖、鼠李糖、纖維二糖、甘露醇、菊糖、木糖醇，與菌種鑒定手冊中釀酒酵母糖類發酵結果一致。

2.3.3 碳源同化試驗

對Y17aM3和Y17進行碳源同化試驗，結果如圖8。對比了兩株菌同化碳源的能力，發現 Y17aM3對葡萄糖、麥芽糖、果糖、可溶性淀粉、菊糖的同化能力稍有降低，而幾乎喪失了對半乳糖的同化能力，但對糊精特別是乳糖的同化能力提高了，而Y17幾乎沒有同化乳糖的能力。

圖8 Y17和Y17aM3碳源同化實驗結果Fig.8 The results of carbon source assimilation of Y17 and Y17aM3

2.3.4 氮源同化試驗

對Y17aM3和Y17進行碳源同化試驗，結果如圖9。Y17aM3除了對大豆蛋白胨的同化能力提高了，對其余幾種氮源同化能力與Y17出發菌大致相同。因此在糖蜜培養基中加入大豆蛋白胨可以促進Y17aM3的生長。

圖9 Y17和Y17aM3氮源同化實驗結果Fig.9 The results of nitrogen source assimilation of Y17 and Y17aM3

2.3.5 耐糖性

葡萄糖對Y17aM3生長的影響結果如圖10-a。在低濃度的葡萄糖中都能良好生長，當葡萄糖濃度＞5%時，Y17aM3的生長隨葡萄糖濃度的增加而減慢；當葡萄糖濃度為60%時，Y17aM3的生長完全被抑制。

2.3.6 耐酸性

麥芽汁培養基初始pH對Y17aM3生長的影響結果如圖10-b。當pH為3.5～5.5時，Y17aM3的生長隨初始pH的增大而逐漸加快；當pH=5.5時，Y17aM3生長最快；當pH＞5.5時，Y17aM3的生長明顯減慢。因此，Y17aM3的最適生長pH為5.5。

2.3.7 耐糖性

培養基中鹽濃度的變化可以影響酵母的好氧量、生長速度以及發酵率等方面的生理功能。麥芽汁培養基中KCl對Y17aM3生長的影響結果如圖10-c。隨著KCl濃度的增加，Y17aM3的生長受到不同程度的抑制，當KCl濃度達160 g/L時，Y17aM3基本不生長。

圖10 葡萄糖、初始pH和KCl對Y17aM3生長的影響Fig.10 The effect of glucose, initial pH and KCl on the growth of Y17aM3

2.4 發酵培養優化

2.4.1 最適接種量確定

研究了接種量對Y17aM3生長及生產RNA的影響，結果如圖11。隨著接種量逐漸增加，Y17aM3生產RNA含量逐漸提高，大于10%時Y17aM3生產RNA含量逐漸降低。因此最適接種量為10%，此時Y17aM3生長 OD600最高為 15，RNA產量最高達到 112 mg-RNA/g-DCW。

圖11 接種量對Y17aM3生長及生產RNA影響Fig.11 The effect of inoculation on the growth and RNA production of Y17aM3

2.4.2 最適初始pH確定

pH對釀酒酵母生長代謝有重要影響作用，研究了pH對Y17aM3生長及生產RNA的影響，結果如圖12。初始pH為3.5～5.5時，Y17aM3隨著初始pH升高而生長加快及RNA產量增加，初始pH為5.5～7時，Y17aM3隨著初始pH升高而生長減慢及RNA產量減少。因此，最適初始pH為5.5，此時Y17aM3生長OD600最高為 14，RNA產量最高為 112 mg-RNA/g-DCW。

圖12 初始pH對Y17aM3生長及生產RNA影響Fig.12 The effect of initial pH on the growth and RNA production of Y17aM3

2.4.3 最適溫度確定

適合的溫度有利于釀酒酵母更好的生長代謝，研究了溫度對Y17aM3生長及生產RNA的影響，結果如圖 13。Y17aM3隨著培養溫度升高而生長減慢及RNA產量減少，因此低溫更有利于Y17aM3生長和積累RNA。最適溫度為26 ℃，此時Y17aM3生長OD600最高為14.5，RNA含量最高為115 mg-RNA/g-DCW，比在30 ℃條件下提高了3 mg-RNA/g-DCW。

圖13 培養溫度對Y17aM3生長及生產RNA影響Fig.13 The effect of culture temperature on the growth and RNA production of Y17aM3

2.4.4 氮源對Y17aM3生長和生產RNA的影響

氮源是微生物生長過程中不可或缺的營養元素[24]，其主要功能是合成含氮物質。研究幾種氮源對Y17aM3生長及生產RNA的影響，結果如圖14。添加大豆粉能明顯促進Y17aM3的生長，生長OD600由14提高至14，但是對酵母生產RNA沒有明顯促進作用；添加酵母提取物也能明顯促進Y17aM3的生長，生長OD600由14提高至17，且RNA含量提高至119 mg-RNA/g-DCW，提高了7 mg-RNA/g-DCW；其中蛋白胨對Y17aM3的生長和生產RNA促進作用最明顯，生長 OD600由 14提高至 17，RNA含量提高至 122 mg-RNA/g-DCW，提高了10 mg-RNA/g-DCW。

圖14 氮源對Y17aM3生長及生產RNA影響Fig.14 The effect of nitrogen source on the growth and RNA production of Y17aM3

2.4.5 無機鹽對Y17aM3生長和生產RNA的影響

無機鹽是微生物生長不可缺少的營養物質，對微生物合成RNA有重要意義[25]。研究了幾種無機鹽對Y17aM3生長及生產RNA的影響，結果如圖15。只有磷酸對Y17aM3生產RNA促進作用最明顯，RNA含量提高至 119 mg-RNA/g-DCW，提高了 7 mg-RNA/g-DCW，而對Y17aM3生長沒有促進作用亦沒有抑制作用。

圖15 無機鹽對Y17aM3生長及生產RNA影響Fig.15 The effect of inorganic salt on the growth and RNA production of Y17aM3

2.5 釀酒酵母突變菌株 Y17aM3的傳代穩定性分析

應用物理化學方法進行菌種選育得到的突變菌株包含很多隱性突變，且突變性狀不穩定容易發生回復突變，因此對篩選得到的突變菌株進行傳代試驗驗證傳代穩定性是非常必要的[19]。將突變菌Y17aM3連續傳代培養至10代，培養并測定RNA含量，結果如圖16。傳代至10代，生長OD600穩定在14.6～15.0之間，RNA含量穩定在109～112 mg-RNA/g-DCW之間，變化幅度非常小，因此說明經過ARTP誘變得到的突變菌Y17aM3傳代穩定性良好，不易發生回復突變。

圖16 Y17aM3傳代及其生長和RNA含量Fig.16 The growth and RNA content of Y17aM3 passages

3 結論

由于 ARTP誘變對生物的遺傳物質損傷效果明顯、損傷機制豐富，尤其是對于染色體等真核生物的遺傳物質均有很強的損傷效果[26]。本研究通過ARTP誘變選育獲得了在以糖蜜為碳源的搖瓶試驗中 RNA含量比原始出發菌株 Y17提高了 39%突變菌Y17aM3，經過發酵培養條件優化后，RNA含量最高可達122 mg-RNA/g-DCW，達到目前文獻報道的最高水平[2]。要實現工業大規模生產，還需要進一步改進，比如發酵罐流加條件的細化及核酸代謝動力學的建立等。釀酒酵母RNA含量的大幅度提高，將大大降低食品工業中添加劑的生產成本以及增加經濟效益。在研究過程中發現，與傳統的誘變方法相比，ARTP能夠有效造成DNA多樣性的損傷，突變率高，并易獲得遺傳穩定性良好的突變株，將為工業微生物的系統改造提供儀器和方法平臺，有望成為現代生物技術的通用工具。