青藏高原川西北高寒牧區黑麥青貯飼料中耐低溫乳酸菌的分離與鑒定

李世丹,陳仕勇,馬 莉,王 泰

(1.西南民族大學 生命科學與技術學院，四川 成都 610041； 2.四川省阿壩州畜牧科學技術研究所，四川 汶川 623000)

川西北高寒草地位于青藏高原東緣，草地畜牧業是該地區經濟發展的支柱產業。但由于川西北高寒草地海拔高，氣候寒冷，牧草生長期短，冷季長達8個月，一直以來天然草地牧草供給的季節性不平衡嚴重制約著草地畜牧業的高效發展[1]。因此，在青藏高原川西北牧區通過人工種草和天然草地打草調制青貯飼料，不僅是解決冬春季節飼草料嚴重不足的有效措施，同時也是提高畜牧業生產水平的有效手段[2-3]。

牧草青貯料比青干草較好的保持了牧草的營養價值，但受青藏高原氣候條件和調制技術的制約，使青貯料在草地牧業生產中的應用遠不及青干草廣泛[4]。牧草青貯發酵進程最終應是以乳酸菌為優勢的微生物群落演替過程，乳酸菌的種類及其生長特性影響著青貯飼料的發酵品質，因而通過對川西北高寒草地牧草中天然附著的乳酸菌進行分離和鑒定，篩選出適合當地氣候的優良耐低溫乳酸菌株，開發出乳酸菌青貯添加劑，對提升川西北高寒牧區青貯料調制技術和促進青貯料的生產應用具有重要意義[5]。

目前，青藏高原青貯乳酸菌的多樣性與種質資源的研究已備受關注，其中包括從高原傳統發酵乳品分離與鑒定乳酸菌的工作[6]，對高寒地區野生牧草天然附著乳酸菌進行分離鑒定[7]。許冬梅等[8]從青藏高原地區垂穗披堿草、燕麥等分離出148株乳酸菌，進一步分析表明植物乳桿菌、干酪乳桿菌等4種乳酸菌可作為低溫發酵青貯飼料的備選菌株。崔棹茗等[9]對青藏高原地區青稞秸稈青貯飼料中的乳酸菌進行了分離，結果共分離出植物乳桿菌、乳酸片球菌、戊糖片球菌等4種耐低溫、生產快，產酸能力強的菌株。在青貯的制作過程中，不同區域及不同原料青貯中的乳酸菌種類存在差異。目前，對川西北高寒牧區青貯乳酸菌的研究較少，也沒有成功研制出一種應用于生產的商品乳酸菌青貯添加劑[10-11]。因此，以川西北高寒牧區飼用黑麥青貯料為材料，從中分離、篩選適合當地青貯用添加劑的乳酸菌菌株，進一步鑒定乳酸菌種類，并對其生物學特性進行研究，為川西北高寒牧區青貯用乳酸菌添加劑的研制和應用提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 供試材料

供試黑麥(Secalecereale)為課題組引種篩選的新品系M1306。供試材料2017年5月6日種植于四川省阿壩州紅原刷金寺鎮阿壩州畜牧科學技術研究所試驗田。地理座標為N 32°01′、E 102°62′，海拔3 351 m，屬大陸性高原寒溫帶季風氣候，年均溫1.4℃；年均日照時數2 158.7 h；年均降水量749.1 mm，無絕對無霜期。黑麥生長至初花期，于2017年7月26日刈割鮮草450 kg，晾曬萎蔫，切短至4～5 cm，分層裝填并壓實于長95 cm、寬58 cm的3個塑料袋中，用膠帶密封，外套編織袋防護，存儲在室內。青貯60 d后對3袋青貯料分別取樣0.5 kg，混合真空包裝，帶回實驗室進行乳酸菌的分離與鑒定。

1.2 試驗方法

1.2.1 乳酸菌的分離和純化 在無菌操作下取10 g待測青貯料樣品，剪碎放入裝有100 mL無菌生理鹽水的三角瓶，用震蕩儀器充分振蕩，使樣品附著的乳酸菌分散在液體中，靜置后取上清液配置成7個梯度的乳酸菌稀釋液。然后取各稀釋液分別涂布在MRS平板培養基上，靜置約30 min，倒置于20℃恒溫培養箱中低溫厭氧培養48 h，選擇菌落密度適中、生長良好、溶鈣圈明顯的菌落進行革蘭氏染色和過氧化氫酶實驗。確定的乳酸菌菌落采用平板劃線法再進行純化培養，最后將分離純化后的乳酸菌按1∶1比例保藏在30%的甘油中，-80℃低溫冰箱保存。

1.2.2 乳酸菌菌株16S rDNA測定 按照Ezup柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒(上海生工)產品使用說明提取乳酸菌全基因組DNA?；蚱螖U增引物為27F(5′-AGAGTTTGATCCTG-3′)，1492R(5′-TACCTTGTTACGACT-3′)；PCR擴增及反應按常規方法進行[14]，擴增產物送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

1.2.3 不同梯度溫度生長試驗 共設4、10、15、20、25、30、37、45、50℃ 9個溫度梯度，每個梯度設3個重復。在無菌操作臺內，用5 mL EP管裝入MRS肉湯液體滅菌培養基，接種3%的活化后的菌液；然后把接種好的乳酸菌對應分組編號，置于溫培養箱中厭氧培養，并保證除溫度外其他培養條件相同。每個溫度下各乳酸菌菌株培養3 d，目測不同乳酸菌在不同溫度下的生長狀態，采用4級記錄符號(-、±、+、++)記錄結果，乳酸菌在繁殖時，菌體主要沉淀在培養基底部，有的則呈絮狀懸浮在培養基中。在觀察時，培養基底部有明顯乳酸菌集群沉淀，并且培養基內，一半以上充滿菌體，呈絮狀懸浮在試管中，則判定為乳酸菌在這個溫度下生長極好(++)；乳酸菌在培養基底部有沉淀，懸浮的絮狀乳酸菌占培養基的一半，視為乳酸菌生長良好(+)；在培養基底部有少量乳酸菌沉淀，或在培養基中有少量乳酸菌絮狀懸浮，認為此時菌體較少(±)；當培養基內基本觀察不到乳酸菌沉淀，以及培養基內沒有乳酸菌絮狀懸浮，就判定此時培養基內無菌體(-)。

1.2.4 生長曲線繪制 各個溫度下，不同種乳酸菌均培養3 d，用UV-1800型紫外分光光度計測各溫度下不同乳酸菌菌液的D(600 nm)值并記錄，繪制生長標準曲線，觀察乳酸菌對溫度的耐受性。

1.2.5 統計分析 采用EXCEL 2010軟件進行數據統計和曲線圖制作，測序序列采用CLUSTALW進行多重比較，并用MEGA 5.0軟件構建系統發育樹[15]。

2 結果與分析

2.1 乳酸菌菌株16S rDNA基因序列測定及系統進化樹的構建

青貯樣品經低溫培養，分離純化，結合革蘭氏染色和過氧化氫酶試驗，共分離出4株乳酸菌菌株(Y1、Y5、Y7、Y9)。經16S rDNA PCR擴增序列長度分別大于1 450 bp，在GENEBANK中進行16S rDNA基因同源性序列比對鑒定，與標準乳酸菌菌株序列相似性均達到了99%。選用4種乳酸菌參考菌株(表1)與分離的乳酸菌菌株構建系統進化樹(圖1)。經過同源比對及4株乳酸菌菌株聚類結果分析表明，4株菌株分別為乳桿菌屬(Lactobacillus)和腸球菌屬(Enterococcus)，其中菌株Y1為清酒乳桿菌(L.sakei)、Y9為彎曲乳桿菌(L.curvatus)、Y5為植物乳桿菌(L.plantarum)、Y7為屎腸球菌(E.faecium)。

2.2 不同溫度下培養基渾濁度及分析

通過目測不同溫度下在MRS肉湯液體培養基培養3 d后的乳酸菌渾濁度，得到不同溫度下MRS液體培養基的渾濁度目測結果(表2)。

表1 構建乳酸菌系統發育樹的參考菌株Table 1 Referenced lactic acid bacteria used for construction phylogenetic tree

圖1 基于16S rDNA基因序列建立的乳酸菌系統進化樹Fig.1 Phylogenetic tree of 16S rRNA sequences

表2 不同溫度下MRS液體培養基的渾濁度目測結果Table 2 Visual measurement results of turbidity of MRS liquid medium at different temperatures

注：++表示生長極好、+表示生長良好、±表示菌體很少、-表示無菌體

在不同溫度培養3 d后，各個菌株生長情況各不相同，同一溫度下不同菌株生長狀況不同，同一菌種在不同溫度下生長狀況也不相同。4℃時有2株乳酸菌生長良好，其余2株乳酸菌能微弱生長；10℃時有3株乳酸菌生長良好，1株乳酸菌菌體較少；15℃時，3株乳酸菌生長極好，1株乳酸菌良好生長；20～37℃時所有菌株均生長極好；45℃時，3株乳酸菌生長極好，1株乳酸菌良好生長；50℃的條件下，所有菌株均生長微弱。試驗表明，彎曲乳桿菌和植物乳桿菌生長極好的溫度在15～45℃；清酒乳桿菌生長極好的溫度在15～37℃；屎腸球菌生長極好的溫度在20～45℃。

2.3 乳酸菌在不同溫度處理下的生長趨勢

乳酸菌經過72 h培養，不同溫度下的培養基D(600 nm)值繪制的各菌株在不同溫度下的生長曲線不同(圖2)。溫度在4～20℃時，4種乳酸菌隨溫度的升高生長量增大，其中植物乳桿菌、清酒乳桿菌和彎曲乳桿菌生長量較大，屎腸球菌生長量相對較少，20℃時菌體濃度達到較高水平；溫度在20～37℃時，4種乳酸菌的生長量不再增加，均達到穩定，植物乳桿菌、清酒乳桿菌和彎曲乳桿菌菌體濃度稍有增加，屎腸球菌菌體濃度無顯著變化；溫度在37～50℃時，4種乳酸菌的生長量呈下降趨勢，乳酸菌活性受到抑制，植物桿菌和彎曲乳桿菌活性最高，清酒乳桿菌活性最低，屎腸球菌稍高于清酒乳桿菌，菌體濃度不高。當溫度升至50℃時，4種乳酸菌的活性均降低到非常低的水平。因此，4種乳酸菌最適生長溫度基本穩定在20～37℃，在培養溫度20℃以下低溫范圍，植物乳桿菌對低溫的耐受性最好，屎腸球菌對低溫耐受性最低，清酒乳桿菌和彎曲乳桿菌對低溫的耐受性居中，4種乳酸菌均有較好的耐低溫表現。

圖2 各乳酸菌在不同溫度下培養72 h生長狀況Fig.2 Growth conditions of lactic acid bacteria in different temperature after 72 h culture

3 討論

3.1 乳酸菌的鑒定

青貯飼料的乳酸菌多樣性受青貯原料種類的影響，不同原料青貯乳酸菌分類鑒定報道主要有乳桿菌、片球菌、明串珠菌、腸球菌、乳球菌、鏈球菌以及魏斯特氏菌7個屬[14-15]。試驗分離出的4株乳酸菌用形態觀察及生理生化鑒定方法不能把這些菌株鑒定到種的水平。16S rDNA同源序列分析方法常應用于微生物種和亞種的鑒定，當2個鑒定種間的16S rDNA序列同源性大于97.5%，可認為是同一種菌[16-17]。把提取的乳酸菌DNA進行16S rDNA序列擴增，測序結果與標準菌株對比，4株菌的16S rDNA 序列與參考菌株的16S rDNA 序列相似性都在99%，因此，可以認為鑒定結果準確。

3.1 溫度對目測渾濁度的影響

目測MRS肉湯液體培養基渾濁度是判定乳酸菌生長情況最直觀的方法，根據目測渾濁度等級確定植物乳桿菌、清酒乳桿菌、彎曲乳桿菌和屎腸球菌的最適生長溫度均為20～37℃。低溫會降低菌體酶活性，高溫會破壞菌體酶蛋白結構，使得蛋白酶變性，從而讓乳酸菌繁殖受到抑制，菌體濃度降低，所以使得目測渾濁度降低。在適宜乳酸菌生長的溫度范圍內，菌體酶活性高，繁殖速度快，則體現渾濁度大。同一菌株在不同溫度下的繁殖性能不同，則菌液渾濁度觀察結果不同。然而不同的菌種對溫度的耐受性不同，所以表現出來的就是不同乳酸菌在同一溫度下不同的渾濁度。以同類方法研究，尚天翠[18]報道的乳酸菌的最適生長溫度在25～38℃；王夫杰等[19]報道的3株風味乳酸菌生長溫度為32～37℃。

3.2 不同溫度條件對乳酸菌生長的影響

由于乳酸菌對溫度的適應性不同，則其在不同溫度下的生長狀況各異，在各自適應生長的溫度下，繁殖性能良好，隨著溫度的改變，生長適應性減弱，繁殖受到抑制。利用20℃低溫篩選出的乳酸菌只有4株，數量偏少，是低溫抑制了高、中溫菌種的生長活性。低溫會抑制中溫微生物以及高溫微生物的生長，耐低溫乳酸菌的活性也會受到抑制。在溫度較低時，乳酸菌進行物質代謝交換會因為低溫環境的刺激而縮小，代謝速率減慢，使得乳酸菌生長活性受到抑制，導致乳酸菌繁殖代謝性能減弱，所以表現為乳酸菌菌體數量少，D(600 nm)值數值低。乳酸菌屬于好冷性細菌，在一定溫度范圍內，短時升溫會促進乳酸菌繁殖。然而，足夠的高溫會破壞菌體蛋白結構，使蛋白變性失活，從而使得乳酸菌的基數減少，生長減弱，菌體數量變少。生長曲線反映出在高溫范圍D(600 nm)值數值變小，生長曲線呈向下波動，菌體的生長迅速衰弱。

4 結論

植物乳桿菌、清酒乳桿菌、彎曲乳桿菌和屎腸球菌，它們的最適生長溫度為20～37℃；當溫度高于37℃時，4種乳酸菌的生長量下降，當溫度達到50℃時，4種乳酸菌的生長水平非常低；在20℃以下低溫范圍培養均有較好的耐低溫表現。因此，4種乳酸菌均為耐低溫菌株，有望成為川西北高寒牧區青貯料調制用青貯添加劑。