超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)檢測(cè)蜂蜜中多種抗生素殘留的研究

徐宜宏，李曉東，姜玲玲，張 彤，鐘 鈺

（中華人民共和國(guó)沈陽(yáng)海關(guān)，遼寧 沈陽(yáng) 110016）

蜂蜜中含有豐富的果糖和葡萄糖，是大腦神經(jīng)元所需要的主要能量元素，它能很快被人體吸收利用，不僅能夠改善人體的血液循環(huán)、補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)、緩解和恢復(fù)人體疲勞，還能起到潤(rùn)肺止咳、消積通便等作用[1-2]，因此，隨著人們生活水平逐漸提高，蜂蜜的消費(fèi)需求正在逐年增大。然而，在蜜蜂養(yǎng)殖過(guò)程中，蜂群極易感染美洲幼蟲(chóng)腐臭病、歐洲幼蟲(chóng)腐臭病、麻痹病等疾病，不可避免地會(huì)使用到喹諾酮類、四環(huán)素類、磺胺類等抗生素，導(dǎo)致蜂蜜中抗生素殘留問(wèn)題嚴(yán)重，消費(fèi)者通過(guò)食用蜂蜜，間接將這些抗生素?cái)z入到身體中，從而導(dǎo)致體內(nèi)抗生素大量殘留，影響身體健康，因此，建立一種能夠快速、準(zhǔn)確測(cè)定蜂蜜中多種藥物殘留的方法勢(shì)在必行。

目前抗生素殘留檢測(cè)的方法主要有加速溶劑萃取法[3]、液相色譜法[4-5]、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[6-9]等，該文根據(jù)國(guó)內(nèi)外限量要求，建立了蜂蜜中四環(huán)素類、大環(huán)內(nèi)酯類、磺胺類、喹諾酮類、硝基咪唑類等5類24種常用獸藥基于QuEChERS[10-12]技術(shù)提取凈化的超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜的定性和定量方法。經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明該方法準(zhǔn)確、靈敏度高、重現(xiàn)性好，能夠滿足同時(shí)檢測(cè)蜂蜜中多種抗生素殘留的需要。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 主要試劑：甲醇、乙腈均為色譜純；甲酸、乙二胺四乙酸二鈉（Na2EDTA）、無(wú)水硫酸鈉、無(wú)水硫酸鎂、氯化鈉、醋酸鈉均為分析純；C18吸附劑購(gòu)于天津Bonna-Agela公司。

1.1.2 儀器設(shè)備：Acquity UPLC/QTRAP 5500液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀，沃特世公司/AB SCIEX公司；X1R低溫離心機(jī)，Thermo公司；Vortex-Genie 2渦旋振蕩器，Scientific Industries公司；BSA822電子天平，Sartorius公司；CPA225D電子天平，Sartorius公司；N-EVAP111氮吹儀，Organomation Associates公司；Milli-Q Gradient超純水機(jī)，Millipore公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品預(yù)處理：稱取2.0 g樣品于50 mL塑料離心管內(nèi)，加入10 mL含1.0%（V/V）甲酸的乙腈溶液和0.1 g Na2EDTA，振蕩1 min；再加入4.0 g無(wú)水硫酸鈉和1.0 g氯化鈉，渦旋混勻15 s，超聲15 min，9 000 r/min離心5 min；將6 mL上清液加入900 mg無(wú)水硫酸鈉，150 mg C18吸附劑，水平振蕩5 min，使吸附劑和提取液充分接觸；以9 000 r/min離心5 min，靜置10 min沉淀蛋白后，取3 mL上清液于10 mL試管中，40℃下氮?dú)鉂饪s至干。加入1 mL 0.1%甲酸—乙腈（9∶1）的定容液，渦旋混勻后，過(guò)0.22 μm濾膜，供超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLC-MS／MS）測(cè)定。

1.2.2 色譜與質(zhì)譜條件的選擇

1.2.2.1 液相色譜條件的選擇：色譜柱為AC-QUITY UPLCTMBEH C18（100 mm×2.1 mm i.d.，1.7 μm）；柱溫：40℃；樣品室溫度：室溫；進(jìn)樣體積：10 μL；流速：0.2 mL/min；流動(dòng)相 A：甲醇；流動(dòng)相 B：0.1%甲酸水溶液；梯度洗脫條件見(jiàn)表1。

表1 24種抗生素梯度洗脫條件

1.2.2.2 質(zhì)譜條件的選擇：選擇ESI+為檢測(cè)離子源，離子源溫度為550℃；離子噴霧電壓及入口電壓分別為5 500 V和10 V；霧化氣壓力、輔助加熱氣壓力、 氣簾氣壓力分別為345、345、207 kPa；用MRM掃描模式。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取液的選擇優(yōu)化

傳統(tǒng)QuEChERS方法常用的提取液為乙腈，但考慮到蜂產(chǎn)品中含有大量的糖分、水分、酶類，同時(shí)查閱文獻(xiàn)分析，設(shè)計(jì)乙腈、1.0%（V/V）甲酸—乙腈溶液、Na2EDTA的酸性乙腈（含1%甲酸3種提取液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)比較。每類待測(cè)物選取1～2個(gè)代表性藥物測(cè)定回收率，結(jié)果見(jiàn)表2和圖1。

由結(jié)果可知，僅使用乙腈為提取溶劑時(shí)，四環(huán)素類抗生素的回收率較低，這可能與該類物質(zhì)易與蜂蜜中鈣、鎂、鈉等礦物質(zhì)離子螯合形成難溶的鹽類有關(guān)。使用加入Na2EDTA的酸性乙腈（含1%甲酸）作為提取液時(shí)，抑制此類化合物與陽(yáng)離子的螯合，回收率較高，因此，初步選用Na2EDTA的酸性乙腈（含1%甲酸）作為提取液。

表2 提取溶劑種類對(duì)回收率的影響 %

圖1 提取溶劑種類對(duì)回收率的影響

2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

經(jīng)過(guò)反復(fù)試驗(yàn)，得出24種抗生素的最優(yōu)質(zhì)譜條件。各抗生素的檢測(cè)離子見(jiàn)表3。多反應(yīng)監(jiān)測(cè)色譜圖見(jiàn)圖2。

3 方法學(xué)驗(yàn)證

3.1 回收率及精密度

在空白蜂蜜中添加不同含量水平的多種抗生素混標(biāo)，制成模擬加標(biāo)樣品，按上述試驗(yàn)方法操作，同時(shí)做空白對(duì)照。所得到的樣品中各待測(cè)抗生素的添加回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差見(jiàn)表4。

試驗(yàn)結(jié)果表明，在所考察的蜂蜜中，24種抗生素的回收率在68.0%～104.0%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.2%～15.5%，待測(cè)抗生素都能得到較理想的回收率，該方法符合檢測(cè)方法對(duì)精密度的要求。

3.2 線性關(guān)系和檢出限

用空白樣品溶液稀釋混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，制備成不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，在選定色譜和質(zhì)譜條件下，用混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液分別進(jìn)樣，以峰面積（y）為縱坐標(biāo)，以工作溶液的濃度為橫坐標(biāo)，繪制6點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。標(biāo)準(zhǔn)工作曲線、線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)r見(jiàn)表5。向空白樣品中添加不同質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按上述方法進(jìn)行測(cè)定，24種抗生素的檢出限均可達(dá)到1 μg/kg。

4 結(jié)論

該文對(duì)應(yīng)用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)檢測(cè)蜂蜜中喹諾酮類、磺胺類、大環(huán)內(nèi)酯類等多種抗生素殘留進(jìn)行了系統(tǒng)研究，以1%甲酸乙腈—Na2EDTA溶液為提取液，液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀同時(shí)對(duì)蜂蜜中多種抗生素進(jìn)行檢測(cè)。該方法具有操作簡(jiǎn)單、試劑使用量小、檢測(cè)周期短等特點(diǎn)，且最低檢測(cè)限完全滿足目前的市場(chǎng)要求，可在實(shí)際檢測(cè)樣品時(shí)節(jié)約大量人力、物力及時(shí)間成本。

表3 待測(cè)獸藥的質(zhì)譜參數(shù)

圖2 24種抗生素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的TIC圖（橫坐標(biāo)：保留時(shí)間；縱坐標(biāo)：峰高）

表4 蜂蜜中各待測(cè)抗生素不同添加水平下的回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）

表5 抗生素的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限