柑桔黃龍病菌亞洲種菌毛形成蛋白基因序列分析、原核表達及抗血清制備

余乃通 ，李賓賓，2，黎維麗，2，楊 毅 ，劉志昕

（1. 中國熱帶農業科學院熱帶生物技術研究所/海南省微生物學重點實驗室/農業農村部熱帶作物生物學與遺傳資源利用重點實驗室，海南 海口 571101；2. 海南大學熱帶農林學院, 海南 海口 570228；3. 中國熱帶農業科學院環境與植物保護研究所， 海南 海口 571101）

柑桔黃龍病（Citrus Huanglongbing, HLB）是柑桔類作物一種毀滅性病害，嚴重威脅著世界各地柑桔類作物主產區的生產［1-2］。目前該病害已相繼在亞洲、非洲、大洋洲和美洲的50多個國家和地區報道，引起柑桔產業的巨大經濟損失［1，3］。在我國19個柑桔主產區中，已有11個遭受到HLB危害［4-5］。柑桔黃龍病的病原是一種專性寄生于植物韌皮部的革蘭氏陰性菌，屬韌皮部桿菌屬（CandidatusLiberibacter），目前有3個種，即亞洲種（CandidatusLiberibacter asiaticus）、非洲種（CandidatusLiberibacter africanus）和美洲種（CandidatusLiberibacter americanus）［6］，主要由亞洲柑桔木虱（Diaphorina citri）和非洲柑桔木虱（Trioza erytreae）傳播［7］。

近年來，隨著海南綠橙等柑桔類產業的快速發展，柑桔黃龍病也隨之而來和快速傳播［8］。前期，我們從感染HLB的海南綠橙中篩選出表達量較高的1個分泌蛋白，菌毛形成蛋白（Pilus formation protein，408），與菌毛組裝相關［9］。革蘭氏陰性菌含有Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ類等8個不同類型的蛋白分泌系統［10］。研究表明，細菌分泌蛋白對病原菌感染宿主和引起宿主病變等方面起到重要作用［11-13］。柑桔黃龍病菌含有完整的Ⅰ類蛋白分泌系統和不完整的Ⅲ類和Ⅳ類蛋白分泌系統［14］。

本研究從感染HLB的海南綠橙中擴增出408蛋白基因，序列分析表明，408基因與柑桔黃龍病菌亞洲種psy62 株系（GenBank登錄號：CP001677.5）的408基因序列一致［15］。對該蛋白進行原核表達及抗血清制備，得到了特異性強的408抗血清，工作效價在1∶500～1∶10 000之間。本研究制備的408多抗血清為408蛋白的功能研究和柑桔黃龍病菌的蛋白檢測產品開發提供重要基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

感染柑桔黃龍病的綠橙葉片采自海南省瓊海市，-80℃保存；pET32a載體由本實驗室保存；E. coliBL21 （DE3）菌株購自北京全式金生物技術有限公司；EcoRⅤ和XhoⅠ均購自大連寶生物公司；HSTMMIX購自東盛生物公司；植物基因組DNA提取試劑盒購自天根生化科技有限公司；BCIP/NBT底物顯色試劑盒、氨芐青霉素（Ampicillin）、Isopropyl β-D-Thiogalactoside（IPTG）、丙烯酰胺、N，N′-亞甲基雙丙烯酰胺、三羥甲基氨基甲烷（Tris）購自Solarbio公司；十二烷基硫酸鈉（SDS）、甘氨酸、考馬斯亮藍R-250均購自海南愛斯科坦生物公司；PCR產物回收試劑盒購自OMEGA公司；堿性磷酸酯酶（AP）標記山羊抗小鼠IgG購自Biosharp生物公司；辣根過氧化物酶（HRP）標記山羊抗小鼠IgG購自碧云天生物技術公司；其他化學試劑均為國產分析純。

1.2 試驗方法

1.2.1 引物設計 根據柑桔黃龍病菌408分泌蛋白基因（GenBank登錄號：CP001677.5）編碼區核苷酸序列和pET32a載體多克隆酶切位點設計1對特異性引物，408-F （5’-CCG GAT ATC TTG CAT CGT AAG CGC CAA AGA G-3’，下劃線為EcoRⅤ酶切位點）和408-R （5’-CCGTCC TGA CGG GAG GAG AGG AGG-3’，下劃線為XhoⅠ酶切位點），由深圳華大基因股份有限公司（BGI）合成。

1.2.2 總DNA的提取及408基因的克隆 以感染HLB的綠橙葉片為材料，參照天根植物基因組DNA提取試劑盒操作說明進行總DNA的提取，用408-F和 408-R引物進行PCR擴增。PCR擴增體系為：DNA模板2 μL，正反引物各 2 μL（10 μmol/L），dNTPs 4 μL，5×TaqBuffer 10 μL，TaqDNA polymerase 1 μL，加ddH2O到50 μL。PCR程序為：94℃預變性3 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸40 s，共35個循環；72℃延伸10 min。取5 μL PCR產物于1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.3 pET32a-408表達載體的構建 利用OMEGA公司的膠回收試劑盒對408目的基因進行回收，對回收的408基因產物和pET32a載體進行EcoRⅤ和XhoⅠ雙酶切，經T4DNA連接酶將408基因連接到pET32a載體上，轉化大腸桿菌DH 5α菌株，涂布于含50 μg/mL氨芐（Amp）抗性的固體LB平板上，37℃培養箱過夜培養進行抗性篩選。挑取平板上的單克隆菌落，利用408-F和 408-R引物進行菌液PCR鑒定，隨機選取3個大小正確的單克隆菌落送往賽默飛世爾科技（中國）有限公司進行雙向測序。對測序正確的單克隆菌落提取重組載體，進行雙酶切驗證。將經過測序和雙酶切驗證的重組載體命名為pET32a-408。

1.2.4 408蛋白的誘導表達及可溶性分析 對測序正確的重組載體轉化E .coliBL21 （DE3）菌株，挑取平板上的單克隆菌落接種到液體LB培養基（含100 μg/mL的Amp），37℃于200 r/min培養過夜。以1∶50的比例將過夜培養的菌液接種到150 mL液體LB培養基中（含100 μg/mL的Amp），37℃、200 r/min繼續培養，期間取樣測菌液OD600值，待菌液OD600達到0.6～1.0，加入IPTG使其終濃度為1 mmol/L，繼續培養6 h。菌液于12 000 r/min離心，收集沉淀，溶于15 mL的1×PBS緩沖液中，超聲波破碎20 min（連續循環工作4 s，停止8 s）；12 000 r/min 離心5 min，分別取上清和沉淀（溶于8 mol/L尿素的15 mL Lysis buffer）10 μL與等量體積的2×SDS loading buffer混合后，100℃煮沸10 min，進行12%SDS-PAGE凝膠電泳（90 V, 2 h）。

1.2.5 融合蛋白的純化 用含8 mol/L尿素的15 mL Lysis buffer溶解超聲波破碎后的沉淀，8 000 r/min離心除去不溶性物質，上清過0.45 μm濾膜，然后通過Ni2+-NTA親和層析柱進行純化，經washing buffer溶液洗去雜蛋白后，用不同濃度的咪唑（50、100、150、200、250 mmol/L）洗脫液進行洗脫，于12% SDS-PAGE凝膠電泳檢測。將純化后的蛋白于-20℃保存。

1.2.6 抗血清的制備 取純化后溶于150 mmol/L咪唑的408蛋白溶液20 μL與80 μL 1×PBS緩沖液混合，再與100 μL的弗氏不完全佐劑混勻，腹腔免疫小白鼠；而后每隔7 d再次腹腔免疫小白鼠4次（使用弗氏完全佐劑）。最后一次免疫4 d后，對小白鼠進行眼球取血，室溫放置30 min后，于4℃靜置過夜。5 000 r/min離心10 min，取上層血清，分裝后于-80℃保存。同時，使用1×PBS緩沖液作為對照免疫小白鼠，即對照血清。

1.2.7 抗體效價檢測及特異性檢測 使用間接ELISA法測定408多抗血清的效價［16］。將獲得408多抗血清分別按1∶500、1∶1 000、1∶5 000、1∶10 000、1∶50 000、1∶100 000的比例進行稀釋。將純化后的408蛋白（用包被液1∶1 000稀釋）100 μL加入到96孔板中，37℃孵育2 h；1×PBST緩沖液洗滌3次后，加入200 μL的1%BSA封閉液，37℃封閉2 h；重復洗滌3次后，加入100 μL稀釋后的血清，37℃孵育1 h；重復洗滌3次后，加入100 μL HRP標記的羊抗小鼠IgG（1∶3 000），37℃孵育30 min；重復洗滌3次后，加入100 μL TMB底物顯色液，避光條件顯色15 min后，加入50 μL的濃鹽酸終止反應，使用酶標儀測定OD450的值。

取純化后溶于150 mmol/L咪唑的408蛋白溶液20 μL與等量體積的2×SDS loading buffer混合，100℃煮沸10 min變性，于12%的SDS-PAGE凝膠電泳。電泳結束后，將蛋白凝膠和硝酸纖維素膜（NC膜）預先用轉膜液浸泡5 min，放入半干轉膜儀中，電流1A轉膜25 min。轉膜完成后用1×TBST緩沖液清洗NC膜3次；5%脫脂奶粉封閉液進行封閉2 h；1×TBST緩沖液清洗3次后，置于408多抗血清（1∶1 000）孵育1 h；1×TBST緩沖液清洗3次后，置于堿性磷酸酯酶（AP）標記山羊抗小鼠IgG稀釋液（1∶2 000）孵育30 min；1×TBST緩沖液清洗3次后，使用BCIP/NBT顯色試劑盒顯色，拍照保存。

2 結果與分析

2.1 408基因的克隆及其序列分析

以HLB感染的綠橙總DNA為模板，進行PCR擴增，電泳結果見圖1A，在250～500 bp之間有一條特異性DNA條帶，大小為400 bp左右，與目的基因大小一致。測序結果經NCBI blastn分析表明，該基因為柑桔黃龍病菌的408分泌蛋白基因，與Duan等報道的柑桔黃龍病菌亞洲種psy62 株系（GenBank登錄號：CP001677.5）的408基因序列一致［15］，大小為408 bp，編碼135個氨基酸，分子量大小為14.95 ku。

圖1 408基因擴增及pET32a-408質粒酶切驗證

圖2 柑桔黃龍病菌408同源蛋白的多重序列比對

氨基酸比對分析表明，海南柑桔黃龍病菌408蛋白與柑桔黃龍病菌亞洲種的408蛋白同源性為69.7%～100%；與馬鈴薯斑紋病菌（CandidatusLiberibacter solanacearum）的408蛋白同源性在35.2%～48.9%。NCBI保守結構域（NCBI conserved domain）預測分析表明，本研究獲得的408蛋白含有1個高度可信的菌毛形成蛋白N端結構域（Pilus formation protein N terminal domain），以及C端含有兩個高度保守的基序，Motif 1和Motif 2；對菌毛形成蛋白N端結構域進行同源比較，結果表明，本研究獲得的408蛋白其菌毛形成蛋白N端結構域與其他柑桔黃龍病菌亞洲種408蛋白的該結構域同源性均為100%，而與馬鈴薯斑紋病菌408蛋白的該結構域同源性為60.2%～63%，說明該結構域具有高度保守的種屬特異性（圖2）。

2.2 原核表達載體的構建

測序結果表明，3個單克隆菌中的408基因插入片段大小正確，堿基無缺失、突變發生，且編碼框無移位。雙酶切驗證如圖1B所示，特異性獲得酶切后的408基因和pET32a載體片段。將經過測序和雙酶切驗證的重組載體命名為pET32a-408，作為后續原核表達的重組質粒。

2.3 408蛋白的原核表達及可溶性分析

將pET32a-408重組載體轉化BL21 （DE3）表達菌，挑取轉化平板上的單克隆菌落接種到含氨芐抗性的LB液體培養基進行誘導表達，分離上清和沉淀進行可溶性分析。12% SDSPAGE凝膠電泳表明，與未誘導的重組菌相比，經1 mmol/L IPTG誘導6 h后的重組菌在分子量大小約34 ku處，出現一條清晰的蛋白條帶（圖3A），與預測的408融合蛋白33.82 ku大小基本一致，即408融合蛋白。可溶性分析結果表明，408融合蛋白主要以沉淀形式（包涵體）表達（圖3B）。

圖3 408融合蛋白的原核表達及可溶性分析

2.4 融合蛋白純化

由于408融合蛋白含有His標簽，可經過Ni2+-NTA親和層析柱純化。將含有408融合蛋白的包涵體沉淀溶解，用不同咪唑濃度的洗脫液洗脫純化，最后用SDS×PAGE分析該蛋白在不同咪唑濃度洗脫液中的分布情況，結果見圖4，經100 mmol/L咪唑的洗脫液洗脫后，Ni2+-NTA親和層析柱上的雜蛋白可除去大部分；再經150 mmol/L咪唑的洗脫液洗脫后，大部分408融合蛋白從Ni2+-NTA親和層析柱中洗脫下來，而在200、250 mmol/L咪唑的洗脫液中分布很少。由此可見，經不同咪唑濃度的洗脫液洗脫后，408融合蛋白主要在150 mmol/L咪唑的洗脫液中分布，于-20℃保存，備用。

圖4 不同濃度咪唑溶液對408融合蛋白的洗脫

2.5 408多抗血清效價及特異性

對408多抗血清進行不同比例稀釋，以純化后的408融合蛋白（1∶1 000稀釋）為抗原，通過ELISA方法對408多抗血清進行效價測定。結果分析表明，與對照血清相比，408多抗血清在稀釋 500、1 000、5 000、10 000倍時，408多抗血清呈明顯的陽性反應（判斷標準為408 PcAb的OD450值/PBS PcAb的OD450值＞2.1）；而408多抗血清在稀釋10 000倍以上均不能很好地呈陽性反應（圖5）。Western blotting結果分析表明，408多抗血清能與純化后的融合蛋白起特異性反應，無其他明顯雜帶（圖6）。

圖5 408多抗血清效價檢測

圖6 Western blot檢測408抗體的特異性

3 結論與討論

前期，我們通過PCR、qPCR和RT-qPCR的方法從感染HLB的海南綠橙樣品中篩選出1個表達量高的柑桔黃龍病菌分泌蛋白408，參與菌毛的組裝。將408蛋白基因構建到GV1300植物雙向表達載體，通過農桿菌注射煙草進行瞬時表達，共聚焦顯微鏡觀察表明，在煙草細胞的細胞核和細胞質種觀察到綠色熒光，說明408蛋白定位于煙草細胞的細胞核和細胞質中［9］。序列分析表明，408蛋白除了含有菌毛形成蛋白N端結構域外，其C端還含有兩個高度保守的基序，Motif 1和Motif 2。這兩個高度保守的基序可能與其在宿主細胞的功能相關，調控宿主的相關代謝或重要通路。但是，408蛋白在宿主體內具體的功能和機理有待進一步研究。

目前，柑桔黃龍病的有效檢測方法包括PCR［17］、環介導等溫擴增技術（LAMP）［18］、熒光定量PCR［19］、重組酶聚合酶擴增方法（RPA）［20］等診斷技術。雖然柑桔黃龍病菌相關蛋白基因的單克隆和多克隆制備也已報道［14，21-23］，但是目前尚無商業化的蛋白檢測產品。408蛋白是柑桔黃龍病菌的分泌蛋白，是菌毛蛋白的重要組成成分，因此，它的含量是病菌含量的幾千倍甚至是幾萬倍以上。另外，我們通過對408蛋白的免疫原性分析發現，其N端到C端的免疫原性較好。本研究不但豐富了制備HLB蛋白檢測產品的選擇，同時使用該蛋白制備的單克隆抗體或多克隆抗體產品具有更高的效價和靈敏度。

柑桔黃龍病病菌根據病原的傳播媒介、序列特征和熱敏性等可分為亞洲種、非洲種和美洲種。根據408蛋白基因的序列分析，感染海南綠橙的黃龍病菌為亞洲種，與我國其他地區柑桔類作物上報道的黃龍病菌屬于同一個種［24］。因此，使用本研究制備的抗體不但能用于海南綠橙黃龍病的檢測，也可用于我國其他柑桔類黃龍病的檢測。