延安產2種蒿類揮發油提取及抑菌活性分析

艾飛翔，周靖怡，馬 秋 ，張恩生，陳小莉，胡華林，李 ?，楊 華

（1.延安大學化學與化工學院，陜西 延安 716000；2.貴州省中國科學院天然產物化學重點實驗室/貴州醫科大學天然產物化學重點實驗室，貴州 貴陽 510014）

植物源殺菌劑具有高效、低毒、無毒、易降解、選擇性高、不產生抗藥性等優點，近年來作為“環境和諧農藥”受到人們的廣泛關注［1］。其中，植物揮發油殺菌劑占有重要比例［2-6］。青蒿（Artemisia carvifolia）和白蒿（Herba artimisiae sieversianae）均屬菊科（Compositae）蒿屬（Artemisia）植物，為傳統中藥，已有研究報道了不同產地白蒿和青蒿的揮發油成分及抑菌活性。采用水蒸氣蒸餾法提取不同產地、不同季節的青蒿（A. carvifolia）揮發油，結果表明不同產地和不同季節的青蒿揮發油的主要成分及含量各不相同［7-11］；采用紙片法測定青蒿揮發油的抑菌活性，結果表明青蒿揮發油對大腸桿菌和茄鏈格孢菌具有顯著的抑制作用［11］；采用水蒸氣蒸餾法提取不同地方、不同季節的白蒿揮發油，結果表明，在白蒿揮發油中脂類、醇類、烷烴類化合物、萜烯類含量較多［12-16］；Zhimin等［13］發現白蒿揮發油對玉米象鼻蟲有熏蒸活性和接觸毒性，其 LC50和 LD50值分別為15.0、112.7 mg/L；呂敏蘭［16］報道了白蒿揮發油的抑菌效果會隨著生長期的不同而變化。

由此可見，不同產地、不同季節植物的化學成分及含量不同，導致植物提取物生物活性的改變。延安位于陜西省北部，屬黃土高原丘陵溝壑區，平均海拔1 200 m左右，屬于暖溫帶半濕潤易旱氣候區，特殊的地理氣候造就了延安產植物化學成分及活性有別于其他地方產的植物。鑒于延安產青蒿和白蒿從未被報道過，本研究擬通過水蒸氣蒸餾法提取其揮發油，分析其化學成分，并對揮發油進行抑菌活性測試，以期為該類植物累積實驗數據，為其應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試植物：青蒿和白蒿，于7月份采摘于延安境內。

供試真菌：腐皮鐮刀菌（Fusarium solani）、人參銹腐菌（Cylindrocarpon destructans）、菌核菌（Sclerotinia sclerotiorum）、油菜菌核（Sclerotinia sclerotioru）、立枯絲菌核（Rhizoctonia solani）、梨黑星病（Venturia nashicola）、煙草赤星病菌（Alternaria alternata）、 根 腐 菌（Fusarium solani）、蒼術黑斑病菌（Alternaria tenuissima）菌種，均由貴州省中國科學院天然產物化學重點實驗室提供，4℃冷藏保存。

供試細菌：綠膿桿菌（Pseudomonas aeruginosa）、金黃葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、大腸桿菌（Escherichia coli）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、青枯菌（Ralstonia solanacearum），均由貴州省中國科學院天然產物化學重點實驗室提供，4℃冷藏保存。

試劑：蒸餾水（實驗室自制）、乙醚（分析純）、無水硫酸鈉（分析純）。

儀器：N-1100型旋轉蒸發儀，水蒸氣蒸餾裝置、中草藥粉碎機、日本島津QP2010型氣相色譜-質譜聯用儀。

1.2 試驗方法

1.2.1 揮發油的提取 將采集的青蒿和白蒿植物樣品陰干，粉碎，過孔徑900 μm篩，稱量500 g，置1 000 mL圓底燒瓶中，加水500～900 mL，浸泡12 h，連接好水蒸氣蒸餾裝置。用電熱套緩緩加熱圓底燒瓶至沸騰，并一直保持微沸狀態約5 h，直至無油狀物流出為止。用等體積的乙醚萃取餾出液3次，合并乙醚層，用無水硫酸鈉進行干燥，過濾掉無水硫酸鈉，用旋轉蒸發儀去除乙醚，得到揮發油，密封4℃保存備用。

1.2.2 GC-MS法確定揮發油成分 氣相色譜條件：色譜柱為彈性石英毛細管柱（ZB-5MSI，30 m × 0.25 μm × 250 μm）。用正己烷配制成150 mg/mL的2種植物精油溶液。程序升溫：初始溫度46℃保持 2 min，以4℃/min 升至206℃，再以 8℃/min升至310℃保持 3 min，然后青蒿和白蒿精油在310℃條件下分別運行 44 min和46 min。柱子參數：汽化室溫度 250℃，接口溫度 280℃，進樣量 1 μL，載氣為 99.999%高純氦氣，柱前壓 0.0528 MPa（7.65 psi），載氣流量 1.0 mL/min，分流比 20∶1，溶劑滯后時間 4.0 min。

質譜條件：電子能量70 eV，離子源為 EI源，EI 源溫度230℃，發射電流 34.6 μA，四極桿溫度 150℃，倍增器電壓1 482V，質量范圍 29～500 amu。

青蒿、白蒿揮發油用氣相色譜-質譜-計算機聯用儀進行分析鑒定，各峰經質譜計算機數據系統檢索，標準圖譜庫Nist 2005和Wiley 275，確定揮發油的化合物結構，用峰面積歸一化法確定各化學成分的相對含量。

1.2.3 抑制真菌活性測定 將供試樣品用DMSO溶解，在無菌條件下用PDA培養基稀釋至2.0 mg/mL，使DMSO含量不超過5%，以1.1所示供試真菌為測試菌，利用抑制菌絲生長速率法［17］測試供試樣品抑制真菌的活性，以等量DMSO為對照，3次重復。放置于25℃培養箱中培養，72 h后用十字交叉法測定供試菌菌落生長直徑，計算菌絲生長抑制率：

1.2.4 抑制細菌活性測定 采用96孔板微量稀釋法［18］：將2種精油用5%DMSO配成2.0 mg/mL的溶液，以含有1.1所示供試細菌的BPB培養基進行2倍稀釋，以無菌培養液和5%DMSO溶液為空白對照，3次重復。微孔板震蕩混合后，置于37℃培養箱內培養18 h后觀察結果，肉湯無渾濁的孔中的最低藥液質量濃度為樣品對供試細菌的最低抑菌質量濃度（MIC）。

2 結果與分析

2.1 青蒿和白蒿揮發油的抑制真菌活性分析

檢測了青蒿和白蒿精油對9種植物病原真菌的抑菌活性，結果（表1）表明，青蒿對所測植物病原真菌有一定的抑制作用，但抑制作用均較弱，對梨黑星病菌的抑制作用最強，也僅為68.00%。白蒿對真菌的抑制作用均較強，對供試的9種真菌的抑制率均達到65%以上，對梨黑星病作用最強、為98.11%，對人參銹腐菌、煙草赤星病菌的抑制率均達到90%以上，對立枯絲核菌抑制作用最差，也達到65.62%。

表1 青蒿和白蒿揮發油抑制真菌活性結果

2.2 青蒿和白蒿揮發油的抑制細菌活性分析

本研究檢測了青蒿和白蒿精油對5種供試細菌的抑菌活性，結果表明，兩種精油對綠膿桿菌（P. aeruginosa）、金黃葡萄球菌（S.aureus）、枯草芽孢桿菌（B. subtilis）、青枯菌（R.solanacearum）均沒有抑制作用，對大腸桿菌（E.coli）有一定的抑制作用，MIC均為500 mg/mL。

2.3 青蒿和白蒿揮發油化學成分的GC-MS分析

青蒿揮發油總離子流圖譜見圖1，主要化學成分見表2。由表2可知，從延安產青蒿揮發油中共鑒定出26種化合物，其含量占總含量的67.95%，其中含量最高的為石竹烯氧化物（25.75%），其次為β-蛇床烯（8.31%），斯巴醇和1,1,6,6-四甲基二螺［2.1.2.1］辛烷含量分別為6.06%和6.01%，這幾種物質的總量接近50%，是青蒿揮發油的主要化學成分。

白蒿揮發油總離子流圖譜見圖2，主要化學成分見表3。由表3可知，從延安產白蒿揮發油中共鑒定出49種化合物，占總含量的82.51%，其中含量最高的是萘嵌戊烷（30.37%），其次為匙葉桉油烯醇（12.04%），戊酸戊酯的含量為10.89%，茵陳炔酮的含量也達到7.88%，這幾種成分的總含量超過了60%，是白蒿揮發油的主要化學成分。

3 結論與討論

圖1 青蒿揮發油總流離子圖譜

圖2 白蒿揮發油總流離子圖譜

表2 青蒿揮發油主要化學成分

本研究分析了延安產青蒿和白蒿的揮發油化學成分及抑菌活性，結果表明延安產青蒿成分類型較其他地區略顯簡單，含量最多的成分為石竹烯氧化物（25.75%），β-蛇床烯（8.31%）、斯巴醇（6.06%）、1，1，6，6-四甲基二螺［2.1.2.1］辛烷（6.01%），與重慶等地產青蒿的主要化學成分有所不同［7-8，10，19］。其他地區產青蒿揮發油中蒿酮、桉葉素、樟腦、β-愈創木烯、1，3-二氧雜環戊烷、2-己烯醛、2，4-二甲基-2-戊烯等含量較多，而在延安產青蒿中的含量較少或沒有檢測出。劉芳［20］報道了采自遼寧白城的青蒿的揮發油對幾種植物病原真菌的抑制作用較為明顯。但本研究測試的延安產青蒿揮發油對9種供試植物病原真菌的抑制率不高，均在70%以下，可能是延安產青蒿揮發油中含有的抑菌活性成分較少。

表3 白蒿揮發油主要化學成分

延安產白蒿揮發油所含成分類型較其他地區復雜，主要成分為萘嵌戊烷（30.37%）、戊酸戊酯（10.89%）、匙葉桉油烯醇（12.04%）、茵陳炔酮（7.88%）。文獻［12-15，21-22］報道在哈薩克斯坦、哈爾濱、蘭州等地區所鑒定的白蒿揮發油中含量較多的為桉葉油素、丁酸香葉酯、龍腦、樟腦、月桂烯、1，8-桉葉醚、芳樟醇、2-乙烯基萘、亞油酸、棕櫚酸、巴豆酸乙烯酯等，而這些物質在延安產白蒿揮發油中含量較少或者沒有檢測出。生物活性檢測表明，白蒿揮發油對9種供試真菌的抑制率較高，均在65%以上，其中對人參銹腐菌（C.destructans）、梨黑星病（V. nashicola）、煙草赤星病菌（A. alternata）的抑制率較高，達到90%以上，然而對于細菌的抑制活性較低，對大腸桿菌（E. coli）的MIC值為500 mg/mL。結果表明，白蒿揮發油對于植物病原真菌有較強的抑制作用，具有開發為農用植物源抑菌劑的潛力。

綜上所述，延安產青蒿和白蒿揮發油與產自其他地區青蒿和白蒿的揮發油化學成分和活性均有所不同，這可能受延安特殊的地理地貌、年降雨量、土壤pH、陽光照射時間、空氣濕度等因素的影響，導致了延安產植物的化學成分及其含量與其他地方不同，不同的物質基礎導致其活性也不同［23］。中草藥自古是陜北的三大寶之一，陜北的地理地貌和自然條件影響著某些植物次生代謝產物的累積，因此對陜北產藥用植物活性成分及活性的研究為陜北發展中藥材種植及開發利用具有重要意義。