鹽脅迫對苗期向日葵內源激素含量的影響

李海洋，李愛學，王 成，王曉冬，侯佩臣，李文姣，陳 珂

(1.西南科技大學生命科學與工程學院，四川 綿陽 621000；2. 北京農業智能裝備技術研究中心，北京 100097)

目前世界上7%的土地已經鹽堿化，并且在干旱半干旱地區越來越多的土地使用鹽水灌溉[1], 故鹽害已成為繼干旱之后的第二大環境問題。因此需要更好地了解植物的耐鹽機制，以最大限度地調節植物的生長條件，維持作物的生產力。

植物激素在調節植物對生物及非生物脅迫的響應中發揮著重要的作用。脫落酸(ABA)對多種逆境環境都會發生響應。鹽脅迫下植物中的內源ABA會有一定比例的增加，大多與葉片或土壤的水勢有關[2]。生長素(IAA)可以促進細胞生長及側根和不定根的發生。研究報道，鹽脅迫下谷類等作物中IAA濃度增加，生長受到抑制[3]。赤霉素(GA)主要促進植物莖節的伸長生長和花芽分化，鹽脅迫下GA與其它激素發生交互作用，共同調節植物的生長發育[4]。玉米素核苷(ZR)與ABA 間的平衡作用影響氣孔的開閉, 從而在脅迫適應中起重要作用[5，6]。不同的植物激素在植物體的不同部位合成，并分布到植物的其它部位發揮作用[7]。這些激素可能接近或遠離其合成位點，以調節對環境刺激及發育變化的反應[8]。同一激素在植物不同部位，其含量及作用不同；并且在植物的相同部位，激素含量不同，其發揮的作用也不同。因此，研究植物體不同部位在鹽脅迫下的內源激素變化將有助于深入了解植物激素的作用機制及植物的耐鹽機理。

向日葵作為世界四大油料作物之一[9]，被許多國家廣泛種植[10]。目前，研究者們圍繞鹽脅迫下向日葵的生長和生理特征做了大量研究。于志賢等[11]研究發現，鹽脅迫對不同品種向日葵種子萌發均有抑制作用, 并且隨著鹽濃度升高, 抑制作用增大; 王偉等[12]發現鹽脅迫會影響向日葵的葉面積、株高、膜透性等。Ghader等[13]研究了鹽脅迫下向日葵根莖葉的生理生化變化。但鹽脅迫下苗期向日葵內源激素變化鮮見報道。本研究對苗期向日葵進行不同濃度和時間的鹽脅迫處理，分別測定了向日葵根、莖、葉中吲哚乙酸(IAA)、脫落酸(ABA)、赤霉素(GA)及玉米素核苷(ZR)幾種主要內源激素含量變化，旨在進一步理解向日葵的耐鹽機理，從而為向日葵的品種篩選和生產管理提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗選用油葵種子品種LD5009(北京Kafry科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 向日葵培育 選取顆粒飽滿且大小一致的種子，使用5%次氯酸鈉溶液進行表面消毒10 min后，用無菌二次蒸餾水漂洗數次。將種子置于培養皿，底部墊上濾紙做發芽床，加入去離子水潤濕種子及濾紙，放入植物光照培養箱(光照/黑暗:10 h/14 h；25±2℃/18±1℃；光強4000lx；60%濕度)培養。待長出的胚根長度達到2～3 cm時，移至1/2 Hoagland營養液中水培。水培20 d，取相似生長狀態的植株，移入NaCl濃度為0、50、100 mmol·L-1的Hoagland營養液中，分別進行10、20、30 h的鹽脅迫，每組10株。鹽脅迫處理10、20、30 h后，幼苗生長形態表現為表1，分別采集植物的根、莖、葉部分，保存在液氮中待處理。

1.2.2 樣品預處理 將每株向日葵的根、莖、葉三種樣品分別通過液氮研磨成粉末，準確稱取200 mg粉末樣品，加入2 mL提取液(CH3OH∶H2O∶HCl=2∶1∶0.002)，置于-20℃過夜提取。4℃下14 000 rpm離心5 min，吸取上清液。殘渣加入1 mL提取液混勻，相同條件離心再提取，合并上清液，然后過C-18固相萃取柱。渦旋振蕩后置于室溫下，用氮吹儀吹干除去提取液中的甲醇，用樣品稀釋液定容后待測。

1.2.3 樣品測定 吲哚乙酸(IAA)、脫落酸(ABA)、赤霉素(GA)、玉米素核苷(ZR)含量測定采用酶聯免疫吸附方法(ELISA)，由中國農業大學提供試劑盒及活性測定方法。采用酶聯免疫檢測儀(DG-3022A型，華東電子管廠)測定樣品內源激素IAA、ABA、SA、ZR含量。

1.2.4 結果計算 根據Yang等[14]的方法制備標準曲線。曲線的橫坐標用激素標樣各濃度(ng·ml-1)的自然對數表示，縱坐標用各濃度顯色值的Logit值表示。Logit值的計算方法如下：

其中,B0是0 ng·ml-1孔的顯色值，B是其它濃度的顯色值。待測樣品可根據其顯色值的Logit值從圖上查出其所含激素濃度(ng·ml-1)的自然對數，再經過反對數即可知其激素的濃度(ng·ml-1)。求得樣品中激素的濃度后，再計算樣品中激素的含量(ng·g-1)。

2 結果與分析

2.1 鹽脅迫對植物內源激素IAA含量的影響

由表1可知，較低濃度的鹽脅迫作用時間超過10 h即可引起向日葵幼苗明顯的表型變化，100 mmol·L-1鹽脅迫處理30 h即可使其莖稈倒伏，造成較大損傷。鹽處理條件下幼苗的根、莖、葉中內源激素IAA濃度的變化趨勢如圖1所示，對照組各部位IAA的濃度為莖(72.78±5.47 ng·g-1)>根(59.24±4.76 ng·g-1)>葉(52.16±4.03 ng·g-1)。由圖1b可知，在50 mmol·L-1的鹽脅迫時，IAA在0～20 h 內隨時間的增加其含量也隨之增加，到20 h時達到最大值。期間葉片和莖稈IAA含量增加較為顯著。20 h后各組分的IAA含量急劇下降，30 h時莖稈和葉片的含量基本持平。在100 mmol·L-1鹽脅迫時(圖1c)，根部IAA變化趨勢與50 mmol·L-1時幾乎保持一致，但其葉片和莖稈IAA含量在10 h即達到最大值，然后迅速下降，20 h下降至低于根部含量。表明100 mmol·L-1鹽脅迫下，各組織部位IAA的變化幅度較50 mmol·L-1時更大，變化速度更快。可以看出， 鹽脅迫對向日葵不同組織部位IAA水平的影響不一致, 對葉片和莖稈IAA水平的影響要大于對根部的影響。并且鹽脅迫濃度越高，影響越大。Li等[15]研究發現IAA的合成部位主要在頂芽, 根部IAA的合成數量很少。因此，可能在脅迫初期，植物表現出對鹽脅迫的拮抗，使得葉片和莖稈的IAA含量急劇增大，而根部的增加則較為緩慢。脅迫后期植物的生長受到顯著影響，無法合成滿足生長所需的IAA，IAA含量總體呈現出下降趨勢。100 mmol·L-1鹽脅迫下，在20～30 h期間，葉片和莖稈IAA含量有一個上升的趨勢，可能是鹽脅迫時，IAA含量的下降呈波動性，具體機理有待進一步研究。

表1 鹽脅迫下向日葵幼苗的表型變化

2.2 鹽脅迫對植物內源激素ABA含量的影響

鹽處理條件下幼苗根、莖、葉中內源激素ABA含量的變化趨勢如圖2所示，由圖2a可知，對照組的ABA在向日葵根、莖、葉中的含量不同，葉(68.55±10.99 ng·g-1)>根(37.53±4.85 ng·g-1)>莖(32.43±5.23 ng·g-1)。由圖2b可知，在50 mmol·L-1鹽脅迫下，向日葵根部ABA含量變化并不大，隨著脅迫時間的增加緩慢上升，后期則趨于穩定，而在100 mmol·L-1鹽脅迫下，根部ABA含量變化則較為明顯。50 mmol·L-1鹽脅迫時(圖2b)，0～10 h葉片中ABA含量急劇上升至原來的2倍，而10～20 h時其含量下降，在20～30 h期間其下降趨勢趨于平緩。100 mmol·L-1鹽脅迫時(圖2c)，各組織ABA含量的變化趨勢與50 mmol·L-1時幾乎一致，但葉片中ABA的含量下降幅度更大。Jiménez等[16]研究發現逆境條件會大大增強植物ABA的生物合成，脅迫條件下, ABA的積累主要來自ABA釋放和新ABA的合成。ABA主要在根部合成，然后運輸到其它部位[17]。在對照組，ABA在葉片中含量最高，表明ABA主要運輸到葉片中。脅迫初期，ABA表現增高趨勢，表明ABA在抵抗鹽脅迫中發揮重要作用，其中葉片中ABA的增加值高于根系和莖稈，表明鹽脅迫對植物葉片的影響最顯著，因此引起的植物應激反應也最強，使得合成的ABA大量運輸到葉片中。隨著時間的延長，植物不再耐受鹽脅迫，生長受到抑制， ABA合成減少，根部合成的ABA不能再向上傳輸到葉片，因此葉片中ABA的含量下降也最明顯。

圖1 鹽脅迫下向日葵根莖葉中內源IAA含量變化Fig.1 The variation of endogenous IAA content in the root, stem， and leaves of sunflower seedlings under salt stress

圖2 鹽脅迫下向日葵根莖葉中內源ABA含量的變化Fig.2 The variation of endogenous ABA content in the root, stem， and leaves of sunflower seedlings under salt stress

2.3 鹽脅迫對植物內源激素GA含量的影響

GA可以促進植物莖節的伸長生長及花芽分化。鹽處理條件下幼苗根、莖、葉中內源激素GA含量變化趨勢如圖3所示。由圖3a可知, GA在向日葵幼苗的根系、莖稈與葉片中含量較少，均小于10 ng·g-1，且含量相當接近。在濃度為50 mmol·L-1的鹽脅迫下(圖3b)，向日葵根、莖、葉各組織GA含量變化均保持在 2.0 ng·g-1范圍內，其中葉片和根部都隨脅迫時間的增加保持著平穩的下降趨勢，莖稈在脅迫過程中GA含量有稍許的增加，之后又緩慢下降，在30 h 時向日葵的各組織的GA含量幾乎在同一水平。100 mmol·L-1的鹽脅迫下(圖3c)向日葵根、莖、葉GA也無明顯變化，各組織GA含量變化均在2.0 ng·g-1范圍內。莖稈和葉片的含量隨脅迫時間的增加幾乎保持同一水平，沒有明顯的變化，根系GA含量表現為輕微的下降趨勢。結果表明50 mmol·L-1及100 mmol·L-1鹽脅迫下，向日葵根、莖、葉中GA含量的變化并不顯著，可能與我們采用的是低鹽脅迫，其濃度還不足以引起GA濃度發生較大變化有關。

2.4 鹽脅迫對植物內源激素ZR含量的影響

鹽脅迫下向日葵幼苗根、莖、葉中內源激素ZR含量的變化趨勢如圖4所示。由圖4a可知，向日葵內源ZR的含量也相對較少，對照組各組織中的含量為根(9.40±0.49 ng·g-1)>葉(8.64±0.35 ng·g-1)>莖(5.80±0.79 ng·g-1)。在50 mmol·L-1鹽脅迫下(圖4b)，莖稈和葉片中ZR先上升，后下降，而根部ZR在0～20 h時，含量較為穩定，20 h后開始下降，但下降趨勢低于莖稈和葉片。100 mmol·L-1鹽脅迫時(圖4c)向日葵根、莖、葉GA變化趨勢與50 mmol·L-1鹽脅迫時較為相似，總體呈下降趨勢，對莖稈及葉片的影響要大于根部。這一變化可能與ZR在根部合成有關。脅迫初期，植物發生應激反應，根部合成ZR[18]，供給自身需要并向上運輸到莖稈和葉片部位，而后期植物不再耐受鹽脅迫，ZR的合成減少，不能再運輸到葉片和莖稈部位。因此葉片和莖稈部位下降趨勢較根部明顯。

2.5 鹽脅迫對植物向日葵各組織中內源激素比例的影響

植物對鹽脅迫的響應不是由單一激素的絕對含量決定，而是與各種植物激素的綜合調控有關。研究指出，IAA與ABA 是發揮拮抗作用的激素, 二者的比值變化影響著植物器官的生長與脫落; GA與ABA的比值可以影響種子萌發、性別分化及植物休眠等生理活動。(ZR+IAA+GA)/ABA則可反映幾種激素的平衡狀態。鹽脅迫下向日葵不同部位內源激素間比值如表2所示。由表2可知，在50 mmol·L-1鹽脅迫下，IAA/ABA，GA/ABA，(ZR+IAA+GA)/ABA三種形式的激素比值均出現一個有規律的波動，隨著鹽脅迫時間的延長，表現為脅迫初期激素比值顯著下降，之后出現顯著回升，并再次下降，且后一次下降的趨勢顯著高于前一次(P<0.05)，這種波動趨勢表現了植物對鹽脅迫的拮抗，但最終激素含量表現為下降趨勢，植物生長受到抑制，且向日葵植株的根、莖、葉均表現了類似的趨勢。100 mmol·L-1鹽脅迫下，向日葵根、莖、葉中IAA/ABA，GA/ABA，(ZR+IAA+GA)/ABA激素比值的變化趨勢顯著高于50 mmol·L-1鹽脅迫(P<0.05),說明高濃度鹽脅迫對植物造成了更大的損傷， ABA主要在根部合成有關，同時高濃度脅迫使根部合成的激素不能運輸到莖稈和葉片，進行協同調節。

圖3 鹽脅迫下向日葵根莖葉中內源GA含量的變化Fig.3 The variation of endogenous GA content in the root, stem， and leaves of sunflower seedlings under salt stress

圖4 鹽脅迫下向日葵根莖葉中內源ZR含量的變化Fig.4 The variation of endogenous ZR content in the root, stem， and leaves of sunflower seedlings under salt stress

激素比例Hormone ratio植物組織Plant tissueCK50 mmol·L-110 h20 h30 h100 mmol·L-110 h20 h30 hIAA/ABA根 Root1.58±0.36b1.27±0.21d1.76±0.43a 0.49±0.12f1.48±0.32c 1.60±0.17b0.80±0.11e 莖 Stem2.24±0.55b 1.87±0.44d 2.29±0.24b 0.91±0.13e 2.94±0.63a0.96±0.04e2.12±0.25c 葉 Leaf0.76±0.21a 0.70±0.12b 0.77±0.07a 0.36±0.08d 0.73±0.07b 0.23±0.03e 0.50±0.03c GA/ABA根 Root0.21±0.02a 0.15±0.01c 0.17±0.01b 0.15±0.02c 0.18±0.02b 0.14±0.01c 0.18±0.01b 莖 Stem0.23±0.01a 0.20±0.02b 0.22±0.02a 0.16±0.01c 0.19±0.02b 0.20±0.02b 0.22±0.00a 葉 Leaf0.12±0.02a 0.06±0.02d 0.07±0.01c 0.06±0.01d 0.05±0.02e 0.08±0.01c 0.10±0.01b (ZR+IAA+GA)/ABA根 Root2.04±0.29b 1.61±0.28d 2.16±0.31a 0.78±0.07f 1.86±0.22c 1.92±0.33c 1.12±0. 23e 莖 Stem2.65±0.43b 2.20±0.41d 2.66±0.26b 1.17±0.17f 3.31±0.52a 1.25±0.22e 2.47±0.32c 葉 Leaf1.01±0.12a 0.75±0.09d 0.91±0.08b 0.46±0.03f 0.85±0.11c 0.36±0.01g 0.66±0.02e

注: IAA/ABA：吲哚乙酸與脫落酸的比值；GA/ABA：赤霉素與脫落酸的比值；(ZR+IAA+GA)/ABA：玉米素核苷、吲哚乙酸和赤霉素的總含量與脫落酸的比值。不同小寫字母表示處理間差異顯著(P<0.05)。

Note: IAA/ABA：The ratio of indole 3-acetic acid to abscisic acid；GA/ABA：The ratio of gibberellin to abscisic acid；(ZR+IAA+GA)/ABA：The ratio of total contents of zein nucleoside, indole 3-acetic acid and gibberellin to abscisic acid。Different lowercase letters indicate significant differences between treatments at 0.05 level.

3 討論與結論

植物內源激素是一類重要的生長調節物質。IAA、GA和ZR主要表現為促進生長的作用，而ABA主要表現為生長抑制效果[19]。通過提高自身ABA含量來增加抗性，減緩細胞的分裂速度，從而降低生理需求以及水分蒸發[20]。顏宏等[21]研究了鹽脅迫下外源激素浸種對向日葵萌發的影響，發現ABA在緩解鹽脅迫影響的效果最佳。王鵬等[22]進一步研究了向日葵在鹽脅迫下種子的發芽率以及種子發育期內源激素含量變化，其發育期IAA含量隨著鹽濃度的增加而一直升高，而ABA含量隨鹽濃度增加表現為先平穩后突增的趨勢。早期的研究主要側重于向日葵種子及整體性狀的研究，而植物激素在調節植物對環境的響應中發揮著重要作用，并且植物的不同部位，植物激素的含量及作用均不同。因此有必要對鹽脅迫下向日葵不同組織內源激素的變化進行研究。Brady等[23]研究表明IAA和ABA之間存在信號的通信，ABA和IAA的含量變化可能是鹽脅迫影響植物發育的重要途徑。IAA與ABA之間存在拮抗作用[24]，二者的比值變化影響著植物器官生長與脫落。GA與ABA的比值可以影響種子萌發、性別分化及植物休眠等生理活動[25]，(ZR+IAA+GA)/ABA則可反映幾種激素的平衡狀態。本研究中也分別考察了向日葵根、莖、葉在鹽脅迫下各激素的比值隨鹽脅迫時間的變化。

本研究中鹽脅迫對苗期向日葵根、莖、葉中IAA， ABA 和ZR的變化較為明顯，表明這三種激素在鹽脅迫時發揮了重要作用。GA則沒有顯著變化，可能與使用的鹽濃度較低有關。IAA, ABA 和ZR這三種激素總體表現為先增加后下降的趨勢，鹽濃度越大，植物激素上升或下降的幅度越大，變化速度也越快。可能在脅迫初期，向日葵尚能通過調節這幾種激素的水平降低生理需求，抵抗脅迫。而脅迫后期，向日葵不能再繼續耐受，表現為激素合成下降，生長抑制。通過對根、莖、葉中這幾種激素水平的分析，發現向日葵的葉片和莖稈中這幾種激素的變化趨勢更為明顯，而根部的變化則較為緩慢，表明鹽脅迫對葉片及莖稈的影響更大。另外也與激素的合成及作用部位有關。

IAA、GA和ZR是生長促進激素，ABA是抑制生長的激素，這幾種激素的比值反映了激素對植物的綜合調控。50 mmol·L-1鹽脅迫下，雖然向日葵根、莖、葉中IAA、ABA、GA和ZR這四種激素的變化趨勢不同，但IAA/ABA，GA/ABA，(ZR+IAA+GA)/ABA比值的變化趨勢相似，整體表現為波動性下降，表明向日葵各部位對鹽脅迫表現出一致的抵抗和耐受。而100 mmol·L-1鹽脅迫下，隨著脅迫時間的延長，向日葵根、莖、葉中這幾種激素比值總體呈下降趨勢，但變化則不太一致，表明高濃度的鹽脅迫對植物造成了更大的傷害，使得各部位不能再協同調節，植物生長受到顯著影響。