山核桃林地土壤真菌群落結構研究

李 皓，董建華，袁紫倩，胡俊靖，趙偉明

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山核桃林地土壤真菌群落結構研究

李 皓，董建華，袁紫倩，胡俊靖，趙偉明

（杭州市林業科學研究院，浙江 杭州 310022）

采用16S rDNA高通量測序技術分析杭州臨安區正常生長和不良生長狀況2種山核桃林地土壤真菌群落結構。結果表明，生長不良山核桃林地與正常林地真菌優勢類群相同，不同樣地中子囊菌門Ascomycota、接合菌門Zygomycota、擔子菌門Basidiomycota均為優勢類群，但相對豐度不同，正常林地土壤中擔子菌門和接合菌門的相對豐度高于生長不良林地。在屬的分類水平上，正常林地土壤中小畫線殼屬、鐮刀霉屬和土赤殼屬的相對豐度明顯低于生長不良林地。生長不良林地土壤真菌多樣性高于正常林地，Shannon-Wiener指數，ACE指數，Chao1指數與土壤pH之間呈顯著負相關（<0.05），與有機質、堿解氮和交換性酸顯著正相關（<0.05）。

山核桃；土壤真菌；群落結構；16S rDNA測序

山核桃為我國特有的干果和木本油料樹種，主要分布于浙皖交界的天目山系[1]。浙江省杭州市臨安區是山核桃主產區，種植面積和產量都居全國首位。由于長期采用高強度的經營方式，過量施用化肥和化學除草劑，許多林地土壤環境急劇惡化[2-3]。土壤環境的改變，導致山核桃生長不良，根系枝條死亡，產量大幅下降。要解決這一問題，亟需研究土壤環境發生了怎樣的變化，以便提出山核桃林地土壤科學管理措施。

土壤微生物是土壤環境的組成部分，其種群結構對植物健康狀況有影響。土壤微生物中，真菌除了在氨化、硝化、氮轉化、纖維素分解過程中發揮著重要的作用[4-5]之外，還通過與植物相互作用，進而影響植物生長[6]。近些年，許多植物土壤微生物群落研究都采用高通量測序技術[7-8]。該技術基于16S rDNA測序，通過對Reads過濾，OTUs聚類進行物種分類和豐度分析，再采用Alpha多樣性分析揭示不同樣品群落結構組成和多樣性的差異。

本文采用基于16S rDNA的高通量測序技術分析正常生長和不良生長山核桃林地土壤真菌群落結構和豐度，為山核桃林地的土壤管理和高效栽培提供科學理論依據。

1 材料與方法

1.1 研究區概況

研究區位于浙江省杭州市臨安區龍崗鎮林坑村，地理坐標119°05′35" ~ 119°06′49" E，30°09′27" ~ 30°10′40" N，屬亞熱帶季風氣候，四季分明，氣候溫和，年均降水量1 628.6 mm，年平均氣溫15.8℃，年平均日照時數為1 939 h，全年無霜期234 d。2016年5月，在研究區內開展山核桃林分生長狀況調查。調查發現，研究區內的林分多數為人工純林，林齡在20 ~ 30 a，株行距5 m×6 m。根據林分生長狀況將山核桃林分為2類：（1）正常，山核桃長勢良好；（2）生長不良，多數植株樹葉稀少，枝條枯死或整株死亡。2016年8月，隨機選擇3個正常林地（樣地4，樣地5，樣地6）和3個生長不良林地（樣地1，樣地2，樣地3），每個樣地面積為666.67 m2，海拔187 ~ 230 m，土層厚度90 ~ 100 cm，正常林地內近3 a未施化肥，生長不良林地之前一直施化肥，出現山核桃生長不良癥狀后停施，近1 a未施化肥。

1.2 試驗材料

2016年8月17日，在每個樣地內隨機設5個采樣點，去除表面雜草和浮土，采集0 ~ 20 cm 土層中的土壤，將每個樣地5個樣點采樣土壤充分混合后，一部分用聚乙烯袋密封，帶回實驗室置于－80℃冰箱中保存，另一部分樣品自然風干，用于測定土壤化學性質。

1.3 試驗方法

土壤化學性質測定：土壤化學性質包括pH、有機質、堿解氮、有效磷、速效鉀和交換性酸。其中，土壤pH采用pH計（土水比1:2.5）電位法測定；有機質采用重鉻酸鉀外加熱法；堿解氮采用堿解擴散法；有效磷采用Olsen法；有效鉀采用乙酸銨浸提-火焰光度法；土壤交換性酸采用氯化鉀交換—中和滴定法[9]。

真菌基因組DNA提取和16S rDNA擴增與測序[10]：所有樣品真菌基因組DNA提取和16S rDNA擴增與測序工作委托生工生物工程（上海）有限公司完成。實驗流程為：對提取到的基因組DNA進行瓊脂糖電泳檢測，查看基因組DNA的完整性與濃度。利用Qubit 2.0 DNA檢測試劑盒對基因組DNA精確定量，以確定PCR反應需加入的DNA量。PCR所用的引物已經融合了Miseq測序平臺的通用引物。PCR結束后，對PCR產物進行瓊脂糖電泳，采用生工瓊脂糖回收試劑盒（cat:SK8131）對DNA進行回收。回收產物用Qubit 2.0定量，根據測得的DNA濃度，將所有樣品按照1:1的比例進行混合；混合后充分震蕩均勻。該混合樣品可用于后續的樣品建庫（加測序標簽）與測序。

測序分析流程：采用Flash軟件融合雙末端序列，而后通過各樣品barcode使數據回歸樣品，并對各樣本序列做QC。去除非靶區域序列及嵌合體，采用RDPclassifier將序列進行物種分類，將多條序列根據其序列之間的距離來對它們進行聚類，以序列之間的相似性97%作為域值分成操作分類單元（OTU）。相同的OTU數量越多說明樣本間真菌種類越相近。

1.4 數據處理

運用不同分類水平的OTU分析，說明山核桃林地土壤真菌群落結構。采用Alpha多樣性分析，計算Shannon-Wiener指數，ACE指數，Chao1指數，Coverage等，衡量每個樣本的物種多樣性[11]。使用SPSS 19.0對不同樣地土壤化學性質與真菌多樣性指數進行相關分析。

Shannon-Wiener多樣性指數：

ACE指數：

式中，i表示含有條序列的OTU數目，rare表示含有“abund”條序列或者少于“abund”的OTU數目，abund表示多于“abund”條序列的OTU數目，“abund”為“優勢”OTU的閾值，默認為10。

Chao1指數：

式中，chao1表示估計的OTU數，obs表示實際OTU數，1表示只有1條序列的OTU數目，2表示只有2條序列的OTU數目。

Coverage：

式中，1=只含有1條序列的OTU的數目，=抽樣中出現的總的序列數目。

2 結果與分析

2.1 不同樣地的基本化學性質分析

各樣地土壤基本化學性質見表1。

由表1中可以看出，生長不良的林地（樣地1，樣地2，樣地3）pH均值低于正常林地（樣地4，樣地5，樣地6號），有機質堿解氮和交換性酸的均值高于正常林地。pH低和交換性酸高說明生長不良林地酸化嚴重，堿解氮含量高可能是由于之前施用化肥，導致林地土壤氮素積累較多。

表1 不同樣地土壤基本化學性質

Table 1 Soil chemical properties in 6 sample plots

2.2 不同樣地土壤真菌群落結構分析

通過OTU分析得出，在相似水平為97%的條件下，6個樣地中土壤真菌共有5門19綱74目134科271屬。在門的分類水平上，包括壺菌門Chytridiomycota，聚合菌門Glomeromycota，子囊菌門Ascomycota，接合菌門Zygomycota，擔子菌門Basidiomycota，其中子囊菌門、接合菌門和擔子菌門為主要類群。樣地4，樣地5，樣地6土壤中擔子菌門的相對豐度（19.68%，21.36%，26.57%）和接合菌門的相對豐度（21.73%，30.88%，29.36%）高于樣地1，樣地2，樣地3。

表2 不同樣地土壤真菌優勢門相對豐度

Table 2 Relative abundance of dominant Phylum in 6 sample plots

在屬的分類水平上，被孢霉屬，小畫線殼屬，鐮刀霉屬和土赤殼屬是優勢屬，樣地4，樣地5，樣地6土壤中被孢霉屬的相對豐度（12.95%，11.25%，13.44%）高于樣地1、樣地2、樣地3，小畫線殼屬的相對豐度（1.33%，1.89%，1.97%）、鐮刀霉屬的相對豐度（1.44%，1.14%，1.22%）和土赤殼屬的相對豐度（1.03%，1.64%，1.25%）均低于樣地1，樣地2，樣地3。

表3 不同樣地真菌優勢屬相對豐度

Table 3 Relative abundance of dominat genera in 6 sample plots

2.3 不同林地土壤真菌Alpha多樣性分析

由表4樣地土壤真菌多樣性分析顯示，6個樣地Shannon-Wiener多樣性指數排序為：樣地2>樣地1>樣地3>樣地6>樣地4>樣地5，指數越大，說明群落多樣性越高；ACE多樣性指數排序為樣地1>樣地2>樣地3>樣地5>樣地6>樣地4；Chao1多樣性指數排序為樣地1>樣地2>樣地3>樣地5>樣地6>樣地4；Chao1和ACE指數越大，說明群落豐富度越高。綜合3種多樣性指數，發現生長不良林地土壤真菌多樣性和豐富度均高于正常林地。

表4 不同樣地土壤真菌多樣性

Table 4 Soil fungi diversity in 6 sample plots

2.4 土壤化學性質與真菌多樣性的相關分析

由表5相關分析表明，土壤pH與Shannon-Wiener指數間呈顯著負相關（<0.05），與ACE指數和Chao1指數間呈極顯著負相關（<0.01）。有機質、堿解氮和交換性酸均與3種多樣性指數顯著正相關（<0.05）。

表5 山核桃林地土壤化學性質與真菌多樣性的相關分析

Table 5 Correlation analysis on soil chemical properties with fungi species diversity

注：*表示在0.05水平上顯著相關，**表示在0.01水平上極顯著相關。

3 討論

本研究確定了臨安山核桃林地土壤的優勢真菌類群，生長不良林地與正常林地土壤真菌優勢類群基本一致，但相對豐度有明顯差異，可能是這些差異導致林分生長狀況不同。在門的分類水平上，正常林地土壤中擔子菌門和接合菌門的相對豐度高于生長不良林地。在屬的分類水平上，正常林地中小畫線殼屬、鐮刀霉屬和土赤殼屬的相對豐度明顯低于生長不良林地。兩類林地的種群和豐度差異可能是影響山核桃健康的主要原因。有研究表明，小畫線殼屬、鐮刀霉屬和土赤殼屬的真菌與植物根腐病有關[12-13]，生長不良林地中植株根大量死亡可能和這三個真菌屬的相對豐度較高有關。

本研究中山核桃林地土壤真菌多樣性與pH、有機質、堿解氮和交換性酸有關，pH與林地土壤真菌多樣性之間呈負相關，有機質、堿解氮和交換性酸與林地土壤真菌多樣性呈正相關。pH和交換性酸反映土壤的酸性。生長不良林地比正常林地土壤酸性強，酸性土壤中真菌多樣性會更豐富[14]。生長不良林地中的山核桃植株有大量枝條和根死亡，林地中有機質含量會高于正常林地，土壤有機質含量高，也會使土壤真菌數量和物種多樣性增加[15]。山核桃林生長不良通常和氮肥施用過多有關[16]，生長不良林地之前一直施用化肥，土壤堿解氮普遍高于正常林地，堿解氮含量升高也會影響土壤真菌多樣性[17]。土壤化學性質對真菌群落的數量和組成影響較大，因此不能只根據真菌多樣性來判斷林地土壤環境的優劣。

4 結論

（1）6個樣地中土壤真菌共有5門19綱74目134科271屬。生長不良林地與正常林地土壤真菌群落結構有明顯差異，在門的分類水平上，正常林地土壤中擔子菌門和接合菌門的相對豐度高于生長不良林地。在屬的分類水平上，正常林地土壤中小畫線殼屬、鐮刀霉屬和土赤殼屬的相對豐度明顯低于生長不良林地。

（2）生長不良林地土壤真菌多樣性和豐富度高于正常林地。Shannon-Weiner指數，ACE指數和Chao1指數與土壤pH之間呈顯著負相關（<0.05），與有機質、堿解氮和交換性酸之間呈顯著正相關（<0.05）。

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Soil Fungi Community Structure inForest

LI Hao，DONG Jian-hua，YUAN Zi-qian，HU Jun-jing，ZHAO Wei-ming

（Hangzhou Forestry Academy, Hangzhou 310022, China）

Soil samples in 0-20 cm layers were collected in August of 2016 from six plots at normal and unhealthy growthstands in Lin’an, Zhejiang province. Determinations on chemical properties were implemented and fungi community structure was analyzed by 16S rDNA sequencing. The results indicated that dominant phylums and genera were similar in the two different kinds of soil, including Ascomycota, Zygomycota and Basidiomycota, but relative abundance was different. Relative abundance of Basidiomycota and Zygomycota in normal growth plots was higher than that in unhealthy ones. Relative abundance of,andin unhealthy plots was higher than that in normal ones. Correlation analysis demonstrated that Shannon-wiener, ACE and Chao1 index had significant negative correlation with pH and positive one with organic matter, alkaline nitrogen and exchangeable acidity.

; fungi; community structure; 16S rDNA sequencing

S664.9

A

1001-3776（2018）05-0067-06

2018-04-02；

2018-08-11

山核桃退化林地修復技術應用示范與推廣（2016TS10號）

李皓，工程師，從事經濟林研究；E-mail：38761202@qq.com。

10.3969/j.issn.1001-3776.2018.05.011