核酸純化裝置研制與教學實踐

李 欣, 趙玉紅, 石建黨, 衡 濱, 李小菊, 張偉英, 張金紅, 趙立青

(南開大學 生命科學學院 生物實驗教學中心, 天津 300071)

實驗設備作為開展實驗教學的載體,一直是高校實驗室建設的重點內容[1-2]。當前,市售的儀器設備五花八門,通常具有外形美觀、自動化程度高等優點,但在設計上往往因兼顧通用性而無法與教學實際緊密結合,難以滿足專業基礎教學的具體需求[3-4]。另外,外購設備一般價格較高,功能復雜,也因此而造成維修不便[5]。為此,各高校積極開展實驗儀器設備自行設計和研制活動,這不僅是對實驗教學硬件建設的有力補充,同時在更新實驗教學手段,促進實驗教學改革,提高實驗教學質量和增強師生實踐創新能力等方面都起到不可或缺的作用[6-7]。

我校一直以來都大力支持教師和實驗技術人員自主研發制作實驗教學儀器,并自2017年開始設立了自制實驗教學儀器設備項目基金。我們充分結合實驗教學實際和教學對象特點,自行設計制作了一款核酸純化裝置，并成功應用于實驗教學,取得了良好的實踐效果。

1 技術背景

分子生物學是由生物化學、生物物理學、遺傳學、微生物學等多種學科相互滲透產生的學科[8],是以生物大分子(如蛋白質、核酸等)為研究對象的基礎學科,其發展迅速,前沿性強,應用廣泛,現已成為生命科學各個領域進行深入研究不可或缺的重要工具[9]。分子生物學又是一門實踐性很強的學科,因此所涉及的實驗技術眾多,小量核酸純化技術就是其中一種。

小量核酸的純化是生物實驗教學內容中經常涉及的實驗技術,主要包括質粒DNA的小量提取、DNA瓊脂糖凝膠中目的條帶的回收、PCR或酶切產物純化和細胞或組織總RNA的提取等。目前的純化操作大多選用相應的商品化試劑盒進行,而其中最關鍵的步驟則是核酸在制備管(見圖1)內吸附膜上的吸附結合和反復洗滌,通常采取多次離心的方法來實現。

圖1 制備管結構

但在實驗教學中使用離心法進行核酸的吸附與洗滌存在以下弊端：

(1) 離心后的液體盛接于制備管外部的套管中,這些廢棄液體很可能因操作不慎從制備管下管口進入而造成管內吸附膜上核酸的污染；

(2) 離心機本身在使用上有著諸多要求,待離心的樣品管需要嚴格配平并對稱放置,而且離心法吸附和洗滌核酸通常需要較高的轉速,如果學生操作不當則會威脅到儀器安全，甚至人身安全；

(3) 在受眾面廣的基礎實驗教學中,因離心耗時較長且離心機數量有限,往往會造成學生等待儀器和扎堆操作的現象。

除離心法以外,還可以將制備管的下管口接入真空歧管,再連接真空泵、緩沖瓶和泵管等,以實現對制備管內液體的抽出。但該裝置并非一體化設備,使用麻煩,成本高,占用空間大,且真空歧管本身不易進行清洗和維護。另外,市售真空歧管大多具有數10個緊密排列的制備管插孔,在教學中多人使用時無法保證良好的氣密性和足夠的操作空間。因此,該裝置并不適用于使用者眾多的實驗教學,無法滿足教學工作中的實際需求。

2 裝置結構

本裝置的設計目的就是針對上述問題,提供一種能夠代替離心法和真空歧管的一體化設備,用以提高小量核酸吸附和洗滌的操作效率。該裝置的技術核心是選擇具有較高泵頭轉速的蠕動泵,通過其轉子交替擠壓、釋放泵管,在管內形成一定的負壓進行抽液。主要技術路線是將蠕動泵進水端通過規格匹配的泵管與等徑四通接頭連接,四通接頭剩余的3個接口分別通過泵管與等徑三通接頭連接,以最終實現將單管路分成6個管路。6個管路的泵管分別與6個三通閥(見圖2)的引流口銜接。該三通閥具有2個接口,其中與引流口相對的接口作為制備管下管口的插口；另一個與引流口垂直的接口用于連接外接吸液管,2個接口的不同功能可通過三通閥開關進行切換。

圖2 三通閥結構

外觀上,該裝置為一體化設備,蠕動泵、泵管、多通接頭固定于儀器機箱內部,6個三通閥通過引流口垂直固定于機箱上表面,并且2個三通閥一組,二者連線靠近并平行于機箱上表面的某一邊緣。制備管插口豎直向上,吸液管接口朝向機箱外側并與該三通閥鄰近的機箱上表面邊緣垂直,使外接吸液管自然下垂,并通過機箱外側壁上的固定卡扣收納。機箱后面具有排水孔,用以將蠕動泵出水端通過泵管引出。機箱正面具有電源開關,后面具有電源接口。整個裝置外觀見圖3。

圖3 裝置外觀

3 裝置功能

該裝置提供了6個核酸制備管插口,通過蠕動泵從制備管下管口自動抽液,以實現在數10 s內快速完成小量核酸的吸附與洗滌操作,不僅能夠大大提高核酸純化過程的操作效率,而且制備管中的液體在蠕動泵的作用下即抽即排,廢液不會污染制備管。每個插口分別由三通閥開關控制，以保證多個插口非同步抽液時管路中良好的氣密性和不同制備管在操作時的相互獨立性。另外,每個插口旁還連有外接吸液管,可通過三通閥開關與插口進行功能切換,便于儀器中管路的清洗,同時還可以用于不同實驗中的常規“吸液—棄液”操作,有利于將該裝置的應用范圍進一步推廣。

4 教學實踐

4.1 服務內容與效果

該自制儀器設備主要是為提高實驗教學中核酸純化的操作效率而設計,現已面向本實驗室承擔的多門實驗課程服務,主要包括分別面向本院大二和大三年級伯苓班、生物科學和生物技術專業開設的兩門64學時基礎必修課程——生物化學實驗和分子生物學實驗,所涉及的具體實驗項目有“目的基因的純化與回收”“載體pGEX-4T-2的制備”“目的基因/載體酶切片段的回收”以及“質粒DNA的提取和酶切鑒定”等。除基礎實驗外,該裝置也應用于綜合開放類實驗教學,如在“實時定量PCR分析IPTG對啟動子活性的調節作用”這一綜合性實驗中,需要采用試劑盒法提取大腸桿菌總RNA,該過程中涉及的多次RNA吸附和洗滌步驟就可以通過本裝置輕松完成。另外,該儀器設備還可以實現自動“吸液—棄液”,這一常規操作功能可廣泛應用于不同實驗課程和教學內容當中。

通過近一年的教學實踐,該實驗裝置受到了廣大師生的高度認可與評價,將該自制儀器應用于實驗教學中的反饋效果良好。

4.2 實踐意義

相比離心法,該裝置具有快速高效、操作簡單、無污染及安全隱患等優點；相比真空歧管,該裝置為一體化設備,無需組裝,且體積小,成本低,易清潔。該裝置能夠大大提高學生純化操作速度,且便于多人非同步操作,不僅可有效緩解學生因長時間等待和扎堆使用儀器而導致的課堂擁擠現象,還能避免因學生操作不當而造成的樣品污染，甚至安全問題,提高實驗教學效率和實驗成功率,因而具有較高的實用價值。

自制儀器設備是由教師根據教學實際需要和學生學習特點而設計和制造,相比外購儀器,在實踐教學中具有更強的創新性、實用性和針對性[11-12],更受學生歡迎。同時,在裝置的設計與制作過程中通常需要涉獵多個領域,這就要求教師不斷學習新技術新知識為自己充電,并把所學內容融會貫通,極大地鍛煉了師資隊伍的科學研究、教學研究和創新實踐能力,提高了教師的綜合業務水平[1,13],為進一步提升實驗教學質量,促進實驗教學改革與學科間的交叉融合奠定了良好的基礎[14]。

5 結語

自制實驗教學儀器大多是為解決或者填補現有設備某些功能的欠缺或不足,以便更好地貼合實驗教學需求而自行設計或改進而成的[15]。在我校的大力支持和倡導下,生物實驗教學中心生化與分子生物學實驗室自主設計并制作了核酸純化裝置。該裝置作為不同于真空歧管的一體化設備,不僅消除了以往教學實踐中采用離心法純化核酸所存在的問題和隱患,更具有操作簡便、安全高效、小巧精致、易于維護等優點。目前,該裝置已經成功應用于多門實驗課程中,受到師生的一致好評。以該裝置為代表的自制實驗教學儀器不僅是對商品化設備的有力補充,對于進一步加快和促進實驗教學改革,不斷提高實驗教學水平以及鼓勵廣大師生踴躍創新，更是起到積極的推動作用[16]。