生物質炭源可溶性有機物消減土霉素生物毒性的效應比較

葛成軍 趙媛媛 俞花美 岳林 傅悅 馬瑞陽 程磊

摘? 要? 為探究生物質炭源溶解性有機物（DOM）對土霉素生物毒性的影響，采用水溶液和土壤模擬培養方式，研究不同溫度（350 ℃、500 ℃、650 ℃）制備的木薯渣基生物質炭中溶解性有機物對土霉素脅迫小白菜（Brassica rapa var. glabra）種子發芽、根伸長和芽伸長的影響。結果表明，DOM350和DOM500分別對水培和土培種子的發芽率呈現促進作用，促進率分別為3.33%和10.00%;生物質炭源DOM對土霉素脅迫種子發芽存在緩解作用（P<0.05）;土霉素脅迫下DOM濃度與小白菜種子芽伸長呈顯著相關（P<0.05）;土培條件下，DOM與低濃度土霉素（<34.78 mg/kg）共同促進種子根、芽伸長，對高濃度土霉素（>94.09 mg/kg）存在緩解作用;水培條件下，低濃度DOM對土霉素脅迫種子（B. rapa var. glabra）根伸長呈現緩解作用，DOM濃度與種子芽伸長呈極顯著正相關（P<0.01）。

關鍵詞? 溶解性有機物;土霉素;小白菜;生物毒性;生物質炭

中圖分類號? X53? ? ? 文獻標識碼? A

Comparison of Dissolved Organic Matter from Biochar on Attenuating Biotoxicity of Oxytetracycline

GE Chengjun1， 2， 3， ZHAO Yuanyuan2， YU Huamei2， YUE Lin2， FU Yue2， MA Ruiyang2， CHENG Lei1*

1. College of Life Science， Zhejiang University， Hangzhou， Zhejiang 310058， China; 2. College of Ecology and Environment， Hainan University， Haikou， Hainan 570228， China; 3. Environment and Plant Protection Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences， Haikou， Hainan 571101， China

Abstract? In order to explore and state the possibility effects of dissolved organic matter （DOM） on the biotoxicity of oxytetracycline （OTC）， aqueous solution and soil culture incubation experiments were conducted to investigate the effects of DOM extracted from biochar， derived from the cassava residue at 350 ℃， 500 ℃， 650 ℃， on the pakchoi （Brassica rapa var. glabra） seed germination， root and bud elongation. Results showed that DOM350 and DOM500 had a promoting effect on seed germination rate of Brassica rapa var. glabra in hydroponic and soil culture condition， which was 3.33% and 10.00%， respectively. For DOM-OTC system， there was a significant correlation between DOM concentrations and bud elongation of pakchoi （B. rapa var. glabra） seeds （P<0.05）. Furthermore， DOM had a synergistic effect with low concentration （<34.78 mg/kg） of OTC to promote root and bud extension of seeds， and antagonized the biotoxicity of OTC with high concentration （>94.09 mg/kg） of OTC. However， DOM alleviated the toxicity of OTC on root elongation rate， and had a highly significant effect on shoot elongation of seeds cultured in water （P<0.01）， when DOC concentration at 10 mg/L.

Keywords? dissolved organic matter; oxytetracycline; Brassica rapa var. glabra; biotoxicity; biochar

DOI? 10.3969/j.issn.1000-2561.2019.12.024

隨著畜牧業的發展，大量抗生素被用來預防、治療畜禽疾病，以及促進動物生長。2013年，我國用于畜禽養殖業的抗生素使用量約為8.5 t[1]。研究表明，畜禽攝入的一部分抗生素會在生物體內蓄積，并通過食物鏈傳遞到人類，25%～75%的抗生素以原藥的形式隨畜禽糞便排出體外[2-4]。土霉素作為水產及畜禽養殖中使用最廣泛的廣譜抗生素，由于其半衰期長、不易降解、在動物體內代謝較慢等特點導致土霉素在環境中殘留濃度較高。王冉等[5]經調查研究后發現，我國施肥后的土壤表層抗生素含量較高，土霉素含量達200 mg/kg。土壤中的土霉素經地表徑流、雨水淋濾等過程進一步污染地表水和地下水。

抗生素的濫用不僅對施藥動物產生不利影響[6]，自然水體和土壤動物[7-8]、微生物[9-10]以及陸生[10-11]、水生植物[12]在抗生素脅迫下都會受到一定影響。王盼亮等[13]采用水培試驗研究四環素類抗生素對小白菜幼苗生長的毒性效應發現，當抗生素暴露濃度為16 mg/L時，抗生素對小白菜種子的芽伸長表現出促進作用，同時抑制其根伸長。而Pan等[14]發現黃瓜、西紅柿、生菜和胡蘿卜種子根伸長和芽伸長抑制強度均隨抗生素濃度升高而增強，徐秋桐等[15]也得出了相似的結論。說明不同試驗結論之間差異性較大。

作為一種多孔、高度疏水且比表面積巨大的吸附劑，生物質炭已經廣泛運用于增強土壤肥力、控制環境污染物（抗生素、農藥、重金屬）運移以及調控土壤理化性質當中[16-17]。生物質炭中可溶于水的組分稱作溶解性黑炭，約占淡水環境中溶解性有機物含量的10.6%[18]，具有很強的環境遷移能力。生物質炭施用于土壤后，短期內勢必會引起局部土壤中溶解性有機物（DOM）含量的增多。研究表明，DOM對抗生素有一定的吸附作用[19]，進而減輕抗生素對土壤植物的生態毒性。Albero等[20]研究了施肥條件下7種獸藥抗生素在土壤中的生物有效性后發現，對比未施肥土壤，施肥增強了土壤對抗生素的吸附能力，降低了抗生素在土壤中的生物有效性。前人研究大多側重于DOM對土壤、活性炭、生物質炭吸附環境污染物的影響[21]，有關DOM對抗生素生物毒性影響方面的研究報道尚不多見。為此，本研究以小白菜為受試生物，分別在水溶液和土壤介質中研究了DOM對土霉素生物毒性的影響，探究了DOM修復抗生素污染的可行性，旨在評價生物質炭作為土壤改良劑可能引起的生態毒性，為抗生素污染防治提供科學依據。

1? 材料與方法

1.1? 材料

供試作物為‘揭農三號甜白菜（Brassica rapa var. glabra），由保豐種子商行培育。試驗前先由H2O2浸泡消毒，去除雜物和發育不良的種子后備用。

供試抗生素為土霉素，純度為98%，購自Adamas-beta公司。

供試土壤采自海南大學熱帶農林學院基地，為無污染源農田0～20 cm的海南熱帶磚紅壤。土壤pH 5.31，含水率為15.6 g/kg，有機質含量為2.98 g/kg，全氮、全鉀、全磷含量分別為4.21%，0.76%和0.15%。供試土壤無土霉素檢出。自然風干后研磨，過2 mm篩備用。

為充分資源化利用海南省熱帶農業廢棄物，使其產生環境、經濟和社會效益，達到“以廢治廢”的目的，選用木薯渣作為制備生物質炭的原材料。木薯渣經自然風干后粉碎，限氧條件下在馬弗爐中以200 ℃預炭化2 h后，將溫度分別上升至350 ℃、500 ℃、650 ℃，炭化3 h，待自然冷卻至室溫后取出，制得3種木薯渣生物質炭。根據生物質炭熱解溫度分別標記為MS350、MS500和MS650，過100目尼龍篩，置于干燥密封玻璃罐保存。將過100目篩后的木薯渣生物質炭和超純水按照1∶50（g/mL）的固液比混合置于錐形瓶內，密封。于25 ℃，200 r/min的條件下振蕩24 h。取上清液過0.45 μm水系濾膜所得溶液為DOM。根據生物質炭的制備溫度將提取的DOM分別標記為DOM350、DOM500、DOM650。提取得到的DOM放置于4 ℃冰箱密封避光保存。貯存時間不超過2周。

1.2? 方法

1.2.1? 水培實驗? 實驗共分為4組：（1）空白對照;（2）添加土霉素（添加濃度為10、20、30、40、50 mg/L）;（3）添加3種不同溫度下制備的DOM（DOM350、DOM500、DOM650。DOM添加濃度分別為10、25、50 mg/L）;（4）土霉素與DOM共同作用（土霉素濃度設定為30 mg/L，DOM添加濃度分別為10、25、50 mg/L）。空白對照組添加10 mL的去離子水。在直徑為90 mm的玻璃培養皿中放入2層定性濾紙，將小白菜種子均勻放置在濾紙上，每皿20粒，保持種子培根末端與生長方向呈一直線，蓋好培養皿，每個處理設置3個平行，在25 ℃下避光培養7 d，定期補充培養皿內水分。

1.2.2? 土培實驗? 稱取50 g土壤樣品于90 mm的硬質玻璃培養皿內。實驗共分為4組：（1）空白對照;（2）添加土霉素（濃度分別為0、2、10、20、60、100 mg/kg）;（3）添加3種不同溫度制備的DOM（DOM350、DOM500、DOM650。DOM添加濃度分別為10、25、50 mg/L）;（4）土霉素與DOM共同作用（土霉素的添加濃度為0、2、10、20、60、100 mg/kg。添加DOM濃度分別為10、25、50 mg/L）。每個處理3個平行，并用恒重法的方式保持土壤的最大持水量的60%，穩定48 h后在每個培養皿內加入20粒種子。放入人工氣候培養箱中于25 ℃暗處培養，觀察種子發芽率并每天記錄，觀察至第7天結束。

1.2.3? 測定指標? 測定指標包括小白菜發芽率、根伸長、芽伸長長度。試驗結束后，計算平均值、抑制率及標準偏差，并以濃度-抑制率繪制曲線進行擬合并繪圖。

發芽率=發芽種子數/供試種子總粒數× 100%

根伸長抑制率=[（對照種子平均根長–處理種子平均根長）/對照種子平均根長]×100%

芽伸長抑制率=[（對照種子平均芽長–處理種子平均芽長）/對照種子平均芽長]×100%

1.3? 數據處理

采用Excel軟件和SPSS 22軟件進行數據統計分析以及圖表繪制。采用單因素方差分析比較不同處理對小白菜種子發芽率、根伸長和芽伸長抑制率的影響;采用Duncan法進行多重比較。

2? 結果與討論

2.1? 不同濃度土霉素對小白菜發芽率的影響

由圖1A可知，水溶液培養條件下小白菜種子萌發受土霉素影響較小。除土霉素添加濃度為50 mg/L與其他處理發芽率差距較大以外，其他處理中小白菜種子發芽率基本相同（P<0.05），發芽率趨勢趨于平緩。說明種子發芽率不宜作為反映土霉素生理毒性的指標。

根據預實驗種子發芽情況可知，播種后種子在第3天開始發芽，因此統計發芽率從第3天開始。根據前人研究可知種子的發芽率觀察一般是開始于48 h之后[22]。由圖1B可知，向土壤添加濃度小于10 mg/kg的土霉素溶液對小白菜種子發芽具有輕微的促進作用;而當土壤中土霉素濃度高于20 mg/kg時，種子發芽率明顯被抑制（P<0.05）。這是由于土霉素在土壤中濃度太高以至于超過了種子萌發耐受極限，導致小白菜種子發芽率降低[23]。但隨著天數的增加，土霉素抑制發芽率的效應逐漸減弱。這是因為土壤具有一定的自凈作用。土壤吸附土霉素的量隨接觸時間的增長而增加;未被吸附的部分土霉素被降解[24-25]，土霉素在土壤中的濃度降低，種子的發芽率逐漸趨于平緩。

不同小寫字母表示處理之間差異顯著（P<0.05）。

2.2? 不同DOM對小白菜發芽率的影響

在水溶液培養中（圖2A），除施加了DOM350的小白菜種子發芽率高于空白對照（CK）外，其他溶解性有機物的添加都抑制了小白菜種子的萌發（P<0.05）。Monda等[26]發現對洋薊種子萌發影響最大的水溶性有機物與其激素類芳香結構以及疏水和親水分子含量有關。DOM的疏水和親水分子含量越相近，DOM的構象就更加靈活。再根據Wang等[27]對DOM影響重金屬銅對生菜的毒性和生物有效性影響結論可知，DOM350的分子量可能比DOM500和DOM650的分子量小且小于1 ku。而且DOM350中親、疏水組分含量可能相近。

土壤培養條件下，添加DOM對小白菜萌發的影響如圖2B所示。由圖可知，在土壤培養條件下，DOM350會延緩小白菜種子萌發速率，土壤中添加DOM350后，小白菜種子在第三天時發芽率為10.60%，低于加入了DOM500處理組發芽率大約40%。在第7天時種子發芽率為81.30%，略高于CK組。DOM650的處理效果和DOM350沒有較大差異，其第3天和第7天種子發芽率均小于DOM500。整體上來看，DOM的加入不同程度地提高了小白菜種子的發芽率，證明DOM在一定程度上可以促進種子發芽（P<0.05）。

2.3? DOM對土霉素脅迫下種子發芽率的影響

由圖3可知，在水溶液培養實驗過程中，土霉素對小白菜種子萌發的生物毒性不會隨添加DOM濃度的升高而發生大幅度的變化，但總體來說都起到不同程度的促進作用（P<0.05）。DOM350對30 mg/L土霉素脅迫下小白菜種子的萌發促進程度為1.66%～6.67%;DOM500對30 mg/L土霉素脅迫下小白菜種子的萌發促進程度為6.67%～10.00%;DOM650對30 mg/L土霉素

不同小寫字母表示處理之間差異顯著（P<0.05）。

脅迫下小白菜種子的萌發促進程度為0.00%～ 7.50%。較未添加DOM處理的小白菜種子的發芽情況，DOM會緩解土霉素對小白菜種子的生物毒性。該結論與2.2中DOM對小白菜發芽率的影響實驗中得到的結論一致。DOM對土霉素的吸附作用降低了土霉素的生物毒性[28]，從而促進了小白菜種子的萌發。這與Song等[29]的研究結論相似。

土培條件下3種DOM溶液在土霉素脅迫下對發芽率影響表現為低濃度促進，高濃度抑制的現象（圖4）。研究表明，適量抗生素可刺激土壤微生物活性，進而增強土壤有機炭的礦化，促進植物生長;而抗生素濃度過高會抑制土壤酶和植原體的活性，對植物生長發育造成影響[30]。實驗結束后，種子的發芽率已經基本穩定，大約在70%～90%之間。可能是此時DOM已經吸附土壤中的土霉素，而且已經達到穩定的狀態[31]。不同土霉素濃度處理下種子發芽率差距較實驗前期減少，但過高濃度土霉素還是會對種子發芽率有抑制作用。因此適宜濃度的土霉素則可以小幅度地提高種子發芽率。當實驗進行到第7天時，土霉素-DOM650共存體系中小白菜種子的發芽率最低，這可能是因為生物質炭的炭化溫度越高，土霉素在土壤中的吸附能力越弱，土霉素在土壤中的吸附量也隨之減少，從而影響發芽率[32]（P<0.05）。

2.4? 土霉素和DOM對小白菜根伸長脅迫作用

水培條件下3種不同濃度DOM對土霉素脅迫種子根伸長的影響如圖5所示，根伸長抑制率與DOM濃度之間的回歸方程如表1所示。由圖5可知，在水溶液培養條件下，DOM對土霉素脅迫小白菜種子根伸長的影響不明顯（<10%），在實驗濃度范圍內，3種DOM的濃度越小，DOM對土霉素脅迫小白菜種子根部毒性的緩解作用越強。DOM在水溶液培養條件下對土霉素生物毒性的緩解能力明顯低于其在土壤培養條件中的緩解能力。這可能是因為當土霉素進入土壤環境后，土壤顆粒具有的吸附位點對土霉素有一定的吸附作用[33-34]，一定程度上阻礙了土霉素在土壤環境中的遷移轉化，降低了土霉素的生物毒性。與土壤環境不同，在水溶液培養條件下不存在由于土壤顆粒對土霉素的吸附作用而產生的毒性緩沖作用，小白菜種子的根完全暴露在土霉素溶液當中，根部的生長發育直接受到土霉素的毒性作用。當外源污染物存在于環境中時，根系微生物活性受抑制，營養物質轉化受阻，進而導致作物根尖細胞有絲分裂數減少，分裂速度減慢，導致根伸長被抑制。因此，根對土霉素污染的反應更敏感和直接[35-38]。過高的DOM濃度同樣會對植物種子根部生長產生一定的抑制作用。

如圖6所示，在土壤培養條件下，土霉素濃度為0～20 mg/kg時，小白菜種子根伸長抑制率為負值，說明土霉素在一定濃度區間范圍可以促進種子根伸長。當土霉素濃度大于40 mg/kg時，土霉素對小白菜種子根伸長抑制率約為12.94%，對小白菜根部伸長抑制程度隨土霉素的濃度升高而增加。3種溶解性有機物緩解了土霉素對小白菜根伸長的抑制作用。土霉素濃度越高，3種溶解性有機物對其生物毒性的緩解能力越強，DOM 350、DOM500和DOM650的緩解能力分別為5.00%～27.63%、12.77%～53.13%和2.07%～ 40.30%。由表2根據DOM對土霉素脅迫下小白菜種子根部伸長濃度-抑制率擬合線性方程可知，添加3種生物質炭源DOM均對小白菜根部土霉素耐受能力具有不同程度的增強效果。與不添加DOM的處理對比，在小白菜種子萌發過程加入DOM350，DOM500，DOM650后，根部伸長IC50分別提高了60.17%，146.29%，28.09%。研究表明，DOM對環境中的抗生素、農藥等有機污染物具有一定的吸附作用。DOM可以通過π受位點與有機污染物結合，或對土壤、生物質炭等多孔隙吸附劑產生堵孔效應，阻礙了有機污染物的解吸作用[39-40]，從而影響有機污染物在環境中的生物有效性[41]。

2.5? 土霉素和DOM對小白菜芽伸長脅迫作用

DOM大幅度地降低了土霉素對小白菜種子芽伸長的生理毒性（圖7），3種DOM對小白菜種子芽伸長影響的回歸方程見表3，擬合程度均大于0.8。隨著DOM濃度的增加，小白菜種子芽伸長的抑制率由正轉負，說明較高濃度的DOM對小白菜種子芽伸長有較強的促進作用。DOM350、DOM500和DOM650的緩解幅度分別為33.89%～61.92%、25.52%～63.59%和51.87%～ 72.38%。當DOM濃度為10 mg/L時，僅DOM650可消除土霉素對小白菜芽伸長的抑制作用并促進小白菜芽伸長。隨著DOM施加濃度的增大，3種DOM均可以消除土霉素對小白菜芽伸長的抑制作用。其中DOM650對小白菜種子芽伸長的促進作用最強。

由圖8可知，土壤培養條件下土霉素脅迫下小白菜種子芽伸長抑制率的影響呈低濃度（小于20 mg/kg）促進，高濃度（大于20 mg/kg）抑制的趨勢。其趨勢與2.4實驗中根伸長趨勢相一致。當土霉素濃度處于較低水平時，添加DOM會促進種子芽伸長。不僅因為此時種子細胞分裂素增多，芽伸長速度快，也由于DOM吸附了土壤中的土霉素。當土霉素濃度較高時，芽伸長受土霉素抑制，但DOM溶液可以減輕土霉素毒性對種子芽伸長的抑制作用。由表4根據DOM對土霉素脅迫下小白菜種子芽伸長濃度抑制率擬合線性方程可知，添加3種生物質炭源DOM均對小白菜芽的土霉素耐受能力具有不同程度的增強效果。與不添加DOM的處理對比，在小白菜種子萌發過程加入DOM350，DOM500，DOM650后，芽伸長IC50分別提高了16.69%、114.49%、29.56%。這可能是芽生長過程所需的營養和能量主要來自胚內的養分供應，受外界土壤中土霉素影響不大[42]。

3? 討論

根據高等植物的生長情況監測和判斷土壤的污染程度，是從生態學角度衡量土壤健康狀況，評價土壤質量的重要方法之一[43]。本研究通過觀察土霉素、生物質炭源溶解性有機物（DOM）和土霉素-DOM共存體系對小白菜種子萌發、根伸長和芽伸長的影響。研究發現，小白菜種子萌發的發芽率受低濃度土霉素的影響較小，一方面是由于抗生素的生物毒性明顯比工業化學品緩和，另一方面是因為在培養前期，種皮起到了阻擋種子胚芽與抗生素直接接觸的屏障作用，同時種子發芽所需的營養物質由胚乳提供。當土霉素濃度升高可對小白菜種子萌發產生顯著性影響（P< 0.05），說明高濃度抗生素會對種子萌發產生毒性。

施加DOM可促進種子萌發、根和芽生長。土霉素對小白菜種子根的抑制作用較芽明顯。小白菜對土霉素的敏感順序依次為根伸長>芽伸長>發芽率，根伸長可作為反映土壤被土霉素污染狀況的敏感指標。DOM能夠提高小白菜根和芽對土霉素的耐受能力。這可能是因為DOM作為一種多組分的復雜物質，可以與抗生素等非極性污染物以相似相溶原理結合，從而作為污染物的環境載體[44]，吸附并降低其生物毒性。也可能因為DOM可以增大有機污染物的溶解性，從而促進土壤對有機污染物的吸附能力[45]，降低了抗生素的毒性效應。DOM500對小白菜芽部和根部耐受土霉素提升能力最強，說明DOM能夠提高小白菜芽部和根部對土霉素的耐受能力。

水培條件下，DOM對小白菜芽伸長呈現大幅度的促進作用，并隨DOM濃度的升高而增強;而對小白菜根伸長影響較小，低濃度的DOM對受土霉素脅迫的小白菜根部伸長存在促進作用，但隨著DOM濃度的升高，DOM對土霉素脅迫小白菜根生長的緩解作用逐漸減弱。在實驗濃度范圍內，除DOM350、DOM500和DOM650對土霉素脅迫小白菜種子根生長都存在不同程度的促進作用。Tian等[46]研究了DOM輸入土壤后對土壤酶活性的影響后發現，不同成分的DOM與土壤酶活性之間相關性不同，結合本實驗發現不同DOM濃度對種子根部生長會產生一定的抑制作用，可能是因為DOM350與DOM500、DOM650的組成成分不同，阻礙了土壤中營養物質的轉化過程，減慢了小白菜根尖細胞有絲分裂速度，導致根生長受到抑制。DOM對高濃度土霉素毒性有緩解作用。證明適當地施用生物質炭可降低土霉素對小白菜的生物毒性，但施用量不宜過高。

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