陽離子型納米載體在遞送抗腫瘤藥物過程中的細胞轉運機制及影響因素的研究概況Δ

何麗雅，紀優，周岳茜，盧詩佳，丁寶月，張潔（嘉興學院醫學院，浙江嘉興314001）

目前，化學藥物治療是臨床上治療腫瘤的常用方法，但缺乏靶向性的化學藥物會給患者造成嚴重的毒副作用[1]。采用納米載體包裹化學藥物可以降低其毒副作用，根據納米載體表面所帶電荷的不同，分為陽離子型納米載體、中性納米載體和陰離子型納米載體；與其他兩種納米載體相比，陽離子型納米載體除了可以包載化學藥物，還具有靶向性可以攜帶基因藥物進入腫瘤細胞，在化學藥物治療和基因藥物治療上具有重要地位[2-4]。

目前，已報道的陽離子型納米載體有陽性脂質體、陽離子型樹狀大分子、金屬納米顆粒、聚合物膠束等[5]。這些陽離子型納米載體在生理條件下帶正電，可以與帶負電的基因藥物結合，保護基因藥物不被核酸酶降解，是目前最常用的非病毒基因藥物載體[2-3，6-8]。已上市的轉染試劑Lipofectamine即是陽性脂質體，具有較高的細胞攝取率，其細胞轉染率高達90%以上[5]。細胞膜表面有大量帶負電的蛋白，陽離子型納米載體表面的正電荷可與這些蛋白通過靜電作用相互結合[3，9-10]，然后進入細胞內部。相關文獻報道，表面帶正電的聚酰胺-胺樹狀大分子（PAMAM-NH2）在人非小細胞肺癌A549細胞中的攝取率明顯高于表面不帶電和帶負電的PAMAMNH2的細胞攝取率[11]。目前，關于陽離子型納米載體與細胞膜表面蛋白的靜電結合作用的報道較多，而關于結合之后陽離子型納米載體的細胞轉運全過程的報道較少。細胞轉運包括細胞攝取、胞內轉運和細胞外排[4，12-15]這幾個過程，這些過程直接影響載體所攜帶藥物在胞內的去向和抗腫瘤效果，因此，了解陽離子型納米載體在遞送抗腫瘤藥物過程中的細胞轉運機制十分重要。本研究以“陽離子載體”“細胞攝取”“胞內轉運”“細胞外排”“Cationic carrier”“Cell uptake”“Intracellular transportation”“Exocytosis”等為關鍵詞，組合查詢2000年1月－2018年9月收錄在中國知網、萬方數據、維普網、PubMed、Elsevier等數據庫中相關文獻。結果，共檢索到相關文獻488篇，其中有效文獻44篇。現對陽離子型納米載體在遞送抗腫瘤藥物過程中的細胞轉運機制及影響因素進行歸納總結，為陽離子型納米載體介導的腫瘤靶向給藥系統的設計提供參考。

1 陽離子型納米載體的細胞攝取方式及影響因素

相關文獻報道，納米載體的細胞攝取方式主要有3種：（1）能量依賴的內吞作用[4，13]；（2）細胞膜打孔[16-17]；（3）非能量依賴的膜移位[17]。陽離子型納米載體主要通過前2種攝取方式進入腫瘤細胞[17]，其中通過細胞膜打孔方式進入腫瘤細胞是陽離子型納米載體特有的腫瘤細胞攝取方式。

1.1 能量依賴的內吞作用

小分子、大分子和顆粒狀物質均能通過內吞作用進入細胞[11]。根據內吞物質不同，內吞作用分為吞噬作用和胞飲作用。內吞大的顆粒狀物質（＞200 nm）屬于吞噬作用，是白細胞攝取外源物質的主要方式；內吞細胞外的液體屬于胞飲作用，是大多數細胞攝取外源物質的基本方式[18]。陽離子型納米載體可通過胞飲作用進入腫瘤細胞[11]，胞飲作用根據產生的機制可分為4種：網格蛋白介導的內吞作用、小窩蛋白介導的內吞作用、巨胞飲作用、非網格蛋白和非小窩蛋白依賴的內吞作用[11]。陽離子型納米載體則主要通過前3種機制進入細胞。

1.1.1 網格蛋白介導的內吞作用 大多數腫瘤細胞表面特異性表達的受體，如轉鐵蛋白受體、表皮生長因子受體、CD4受體、低密度脂蛋白受體等，都會觸發網格蛋白介導的內吞作用[14，19-20]。因此連接有轉鐵蛋白、表皮生長因子、CD4、低密度脂蛋白等配體的陽離子型納米載體，主要是通過網格蛋白介導的內吞作用進入腫瘤細胞。當該陽離子型納米載體與細胞膜表面受體結合后，受體移動到細胞膜的有被小泡區，此處細胞膜內表面的網格蛋白幫助細胞膜內陷，形成由網格蛋白包裹的含有陽離子型納米載體為50～250 nm的有被小泡[4]，隨后進入細胞質。

1.1.2 小窩蛋白介導的內吞作用 腫瘤細胞膜表面富含膽固醇和鞘脂類的光滑內陷區被稱為小窩[4]，直徑一般為60～80 nm[18]，小窩內主要含有小窩蛋白。相關文獻報道[14]，陰離子型納米載體多通過小窩蛋白介導的內吞作用進入腫瘤細胞，而陽離子型納米載體只有在特定的配體（氨肽酶、RGD環肽等）介導下才能通過該途徑進入腫瘤細胞。當配體介導的陽離子型納米載體到達小窩時，位于小窩頸部的發動蛋白會促使小窩從細胞膜上分離下來，形成小窩體，隨后到達細胞質[21]。Liu C等[22]設計了cNGR肽介導的聚乳酸-聚乙二醇納米粒（cNGRPLA-PEG NPs），結果發現，該納米粒通過小窩蛋白介導的內吞作用進入腫瘤細胞。另有相關文獻報道[21]，小窩蛋白在一些特定的細胞表面含量較高，如腫瘤血管內皮細胞或與腫瘤微環境相關的成纖維細胞等，當陽離子型納米載體作用于這些細胞時，小窩蛋白介導的內吞作用就是其細胞攝取的主要途徑。

1.1.3 巨胞飲作用 巨胞飲途徑可非選擇性地內吞營養物質和大分子液體物質。在正常情況下，陽離子型納米載體較少通過巨胞飲途徑進入細胞，只在某些刺激下會以該方式進入細胞[23]。巨胞飲過程開始時，細胞膜發生皺褶，形成大且不規則的無包被小泡，即巨胞飲體，直徑為0.5～10 μm。與前2種細胞攝取途徑相比，巨胞飲途徑形成的巨胞飲體的體積較大[14]，可包裹的物質的總量更多，因此，若陽離子型納米載體以巨胞飲途徑進入腫瘤細胞，其在腫瘤細胞中的攝取量則會更多。

1.2 細胞膜打孔

通過細胞膜打孔方式進入腫瘤細胞，是陽離子型納米載體所特有的細胞攝取途徑。相關研究發現[4，24]，陽離子型納米載體表面的正電荷可與細胞膜表面的負電荷結合，使細胞膜表面形成直徑為15～40 nm的孔，陽離子型納米載體可直接通過該孔進入細胞內部。Hong S[25]等研究不同類型的PAMAM-NH2與人口腔表皮樣癌細胞KB的相互作用，結果發現，隨著PAMAM-NH2濃度的增加，細胞內的乳酸脫氫酶和熒光素酶泄漏量逐漸增加，小分子熒光探針碘化吡啶（PI）和二乙酸熒光素（FDA）的胞內熒光強度發生改變，而表面不帶電的聚酰胺-胺樹狀大分子不會引起以上改變，由此說明，PAMAM-NH2增加了細胞膜的通透性；利用原子力顯微鏡觀察到PAMAM-NH2作用腫瘤細胞后，細胞表面產生了納米級別的孔，陽離子型納米載體可以通過該孔自由進出細胞，其他中性或者陰離子型納米載體不能誘導細胞膜產生孔，從而不能通過細胞膜打孔的方式進入細胞。

1.3 影響因素

陽離子型納米載體并非同時通過上述幾種途徑進入腫瘤細胞，在某一腫瘤細胞上的攝取途徑主要由陽離子型納米載體及其給藥系統的粒徑和腫瘤細胞的種類所決定。

1.3.1 陽離子型納米載體及其給藥系統的粒徑 由于各種內吞途徑形成的內吞小泡和細胞膜打孔形成的納米孔的大小是固定的，因此陽離子型納米載體的粒徑是影響其細胞攝取途徑的重要因素之一。相關研究發現[26]，粒徑＜200 nm的陽離子型納米載體可通過網格蛋白介導的內吞作用進入腫瘤細胞，但粒徑＞200 nm的陽離子型納米載體則會通過小窩蛋白介導的內吞作用進入腫瘤細胞。另外，陽離子型納米載體攜帶藥物構成的給藥系統的粒徑大小也會影響其細胞攝取。相關研究發現[27]，陽離子型納米載體攜帶DNA后形成的給藥系統，粒徑小于細胞膜打孔形成的納米孔的直徑（15～40 nm）時，可直接通過小孔直接進入腫瘤細胞，但當該給藥系統的粒徑大于該孔直徑時，給藥系統就只能通過網格蛋白和小窩蛋白介導的內吞作用進入腫瘤細胞。

1.3.2 腫瘤細胞種類 由于不同腫瘤細胞的細胞膜表面所具有的蛋白質的種類和數量不同，因此，同一陽離子型納米載體在不同腫瘤細胞內的內吞途徑不相同。相關研究發現[11]，PAMAM-NH2在人非小細胞肺癌細胞A549中通過非網格蛋白和非小窩蛋白依賴的內吞作用進入細胞，在人乳腺癌耐藥細胞MCF-7/ADR中主要通過巨胞飲進入細胞[23]，在小鼠黑色素瘤細胞B16F10中主要通過小窩蛋白介導的內吞作用進入細胞[28]。另外，陽離子型納米載體作用于與腫瘤生長發育密切相關的腫瘤組織血管內皮細胞（含有豐富的小窩蛋白）時，主要通過小窩蛋白介導的內吞作用進入細胞[22]。

2 陽離子型納米載體的胞內轉運機制及影響因素

胞內轉運過程是陽離子型納米載體被攝取后，部分轉運至溶酶體，部分轉運至細胞質或其他細胞器的過程。

第一個去向（即是否轉運進入溶酶體）主要受內吞途徑的影響。通過網格蛋白介導的內吞作用進入腫瘤細胞的陽離子型納米載體，會被包裹入有被小泡中，進入細胞質，幾秒種后有被小泡失去衣被，成為光滑小泡，隨后與內涵體融合，形成初級內涵體，初級內涵體在移動過程中逐漸被酸化，并最終與溶酶體融合，進入下一步轉運[29]。通過小窩蛋白介導的內吞作用進入腫瘤細胞的陽離子型納米載體，會被包裹入小窩體內，但小窩體在細胞內的轉運機制目前仍然存在爭議[4]。有相關文獻認為，小窩體不與溶酶體融合，而是直接轉移到高爾基體或者內質網，從而避免載體被溶酶體降解[22，30]。通過巨胞飲途徑進入腫瘤細胞的陽離子型納米載體，會被包裹入巨胞飲體中，但是巨胞飲體的轉運過程是否與溶酶體融合的機制還需要進一步的研究[4]。

陽離子型納米載體進入腫瘤細胞溶酶體之后的去向基本相同。陽離子型納米載體表面帶正電，具有質子海綿效應，使溶酶體膜溶脹或者膜通透性增強[23，31]，最終從溶酶體中逃逸出來，進入細胞質中。另有研究發現，PAMAM-NH2可以進入腫瘤細胞的細胞核，具有一定的細胞核靶向性[23]，但關于這方面的報道較少，研究還有待進一步深入。

3 陽離子型納米載體的細胞外排機制及影響因素

腫瘤細胞在攝取外界物質的同時也在不斷地向外排出物質。細胞外排是一個能量依賴的過程，與細胞攝取作用相反[19，32-33]。

3.1 陽離子型納米載體的細胞外排途徑

納米載體的外排由多種細胞器參與[12，34]，陽離子型納米載體的細胞外排過程也一樣復雜多樣。未進入溶酶體的陽離子型納米載體，會被包裹進入胞內小泡，一部分隨著胞內小泡直接循環到細胞膜，隨后小泡與細胞膜融合形成外泌體，陽離子型納米載體被轉移到外泌體中，排出細胞[35]，但通過外泌體排出的陽離子型納米載體所占比例較低[36-37]；還有一部分會隨著胞內小泡轉運至高爾基體、內質網，再通過內質網-高爾基體-細胞膜途徑，向細胞膜移動，與細胞膜接觸、融合，排到細胞外[12，23，34]。進入溶酶體的陽離子型納米載體大部分會逃逸溶酶體，最后通過內質網-高爾基體-細胞膜途徑被排出細胞；極少部分不能逃逸溶酶體的會被溶酶體內各種水解酶消化，然后帶有消化產物的溶酶體與腫瘤細胞的細胞膜接觸融合，將其釋放到腫瘤細胞外[12]。

此外，有一些陽離子型納米載體進入細胞后，會被水解或酶解成生物相容性單體，不能維持原有結構，這些單體會被細胞排出。相關文獻報道[38]，陽性脂質體進入人宮頸癌細胞HeLa和人結腸癌細胞HT-29后，脂質體的脂質雙分子層結構被破壞，降解成磷脂和膽固醇，然后被排到細胞外。另一些結構穩定的陽離子型納米載體（如PAMAM-NH2）進入細胞后，仍然是以完整的納米載體形式，通過上述不同途徑被排出細胞[11，23]。

3.2 影響陽離子型納米載體細胞外排的因素

3.2.1 腫瘤細胞種類 陽離子型納米載體具有一定的細胞毒性，腫瘤細胞對其的外排其實也是一個排毒過程。腫瘤細胞種類不同，其解毒機制也不相同，因此，同一個陽離子型納米載體在不同腫瘤細胞內的外排情況不同[12]。在細胞解毒機制中，細胞內溶酶體參與的解毒過程對細胞外排速率的影響最大；溶酶體膜穩定性和溶酶體內酶含量不同，可導致陽離子型納米載體的細胞外排量不同[12]。Yanes RE等[15]檢測了腫瘤細胞種類對磷酸修飾的二氧化硅納米粒外排的影響，結果發現，溶酶體內的β-氨基己糖苷酶含量對該納米粒外排有很重要的影響，該酶含量不同的人非小細胞肺癌細胞A549、人乳腺癌細胞MCF-7、人黑色素瘤細胞MDA-MB435和人胰腺癌細胞PANC-1對磷酸修飾的二氧化硅納米粒的外排率分別是87%、75%、61%和36%。

3.2.2 陽離子型納米載體的粒徑 陽離子型納米載體的粒徑對其腫瘤細胞外排有一定的影響。相關研究發現，小粒徑的陽離子型納米載體更容易被細胞外排，且外排率比大粒徑載體外排率要高[12]。Ling H等[39]檢測了不同粒徑的介孔氧化硅納米粒在人肝癌細胞HepG2中的外排情況，60、180、370、600 nm的納米粒的外排率分別是63%、67%、58%、38%。載體在腫瘤細胞內有兩種循環過程，一種是經內涵體-溶酶體途徑進入到細胞質，外排速率較快；另一種是經內涵體-溶酶體途徑到細胞膜表面，外排速率較慢。Panyam J等[40]研究發現，粒徑較大的陽離子型納米載體會被轉運到細胞膜表面，導致其外排速率較慢。

3.2.3 陽離子型納米載體的形狀 陽離子型納米載體的形狀是影響其在腫瘤細胞外排的另一個因素。Chithrani BD等[41]研究了不同形狀的金納米粒在人宮頸癌細胞HeLa和人膠質瘤細胞SNB19中的外排情況，結果發現，棒狀的金納米粒在這2種細胞中的外排率明顯高于球狀納米粒。Seib FP等[28]研究了樹枝狀和線性狀的聚乙烯亞胺（PEI）在小鼠黑色素瘤細胞B16F10中的外排情況，結果發現，在1 h內，這2種形狀的PEI外排變化趨勢和外排率相似。因此，陽離子型納米載體的形狀如何影響其腫瘤細胞外排，需要進一步分析，另外關于載體形狀對腫瘤細胞外排影響的機制，目前研究較少，還需要深入研究。

3.2.4 陽離子型納米載體的胞內分布 陽離子型納米載體經過不同的內吞作用進入腫瘤細胞后，有些被轉移到溶酶體，有些被轉運到細胞質的細胞器中。相關研究報道[42-44]，進入溶酶體的陽離子型納米載體最容易被外排，進入線粒體的陽離子型納米載體比細胞質中的更容易被外排。

4 討論

近年來，腫瘤的發生機制已經由組織學水平逐漸發展到細胞學水平。因此，腫瘤靶向給藥系統已經不再是傳統的攜帶藥物到達靶組織，還應攜帶藥物進入靶細胞，同時控制藥物在細胞內靶細胞器的分布和釋放。明確陽離子型納米載體的細胞轉運機制，可以根據其轉運機制有針對性地設計給藥系統。此外，腫瘤細胞內有很多細胞器均有膜結構且帶有電荷，陽離子型納米載體表面的正電荷可能會與其細胞器膜發生靜電吸附作用，從而對細胞器產生一定的靶向作用，但該作用機制仍需要進一步深入研究，以期為開發靶向性更強、抗腫瘤效果更好的腫瘤靶向給藥系統提供參考。