奶牛代謝紊亂與褪黑素應(yīng)用研究進(jìn)展

文/姚昱君 郭江鵬 張 魯 路永強(qiáng) 劉國世＊

（1 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院；2 北京市畜牧總站）

75%的疾病發(fā)生在奶牛產(chǎn)后第1個(gè)月，尤其是營養(yǎng)代謝類疾病，是指機(jī)體代謝功能紊亂形成的疾病。產(chǎn)前3 周到產(chǎn)后2 周左右是奶牛圍產(chǎn)期，圍產(chǎn)期奶牛體內(nèi)新陳代謝發(fā)生巨大的變化，這一時(shí)期發(fā)生代謝紊亂嚴(yán)重阻礙奶牛的生長(zhǎng)發(fā)育，損害生產(chǎn)性能，易形成奶牛繁殖障礙，如繼發(fā)性不孕癥[1]影響生殖周期。

1 奶牛代謝紊亂的發(fā)病原因

奶牛產(chǎn)后真胃變位，前胃遲緩，機(jī)體炎癥造成奶牛食欲下降，采食量低，導(dǎo)致機(jī)體營養(yǎng)供應(yīng)不足。高產(chǎn)奶牛泌乳、妊娠和分娩期間營養(yǎng)需要增加，即便是提高奶牛產(chǎn)后飼料營養(yǎng)、改良飼料適口性增加奶牛采食，奶牛攝入的養(yǎng)分依然無法平衡機(jī)體能量損失。機(jī)體只能通過調(diào)節(jié)代謝，動(dòng)員不同組織能量?jī)?chǔ)備，形成奶牛負(fù)能量平衡狀態(tài)（Negative Energy Balance，NEB），NEB是代謝疾病的病理學(xué)基礎(chǔ)。產(chǎn)后奶牛攝食量不足[2]，飼料能量物質(zhì)過高，碳水化合物和干物質(zhì)比例過低、飼養(yǎng)員技術(shù)經(jīng)驗(yàn)不足，都會(huì)導(dǎo)致NEB形成，進(jìn)而導(dǎo)致代謝紊亂。奶牛攝食量低、食欲不振，既是代謝紊亂的癥狀，也是產(chǎn)生的原因。

1.1 酮病的發(fā)生原因

1894年，Lande首次提出奶牛酮病的概念[1]，奶牛酮病又被稱為奶牛醋酮血癥，其特征是血液、尿液和牛奶中酮水平升高，血糖降低。奶牛酮病有多種類型，分為原發(fā)性、繼發(fā)性、營養(yǎng)型和自發(fā)型。

在N E B期間，奶牛通過分解脂肪和蛋白平衡機(jī)體的能量需求，脂肪分解產(chǎn)生甘油三脂（Triacylglycerol，TAG）使血液中游離脂肪酸（Freefattyacid，F(xiàn)FA）濃度增加，F(xiàn)FA通過肝細(xì)胞β-氧化作用釋放能量生成酮體[3]。同時(shí)奶牛體內(nèi)激素水平受代謝紊亂影響，血糖濃度下降，胰島素分泌減少，胰高血糖素分泌增多。垂體葡萄糖受體激活，促進(jìn)腎上腺素的分泌。β-氧化作用受到胰高血糖素刺激和胰島素抑制。三種激素共同作用，使酮體生成增多，從而形成酮病。

1.2 脂肪肝的發(fā)生原因

脂質(zhì)超過肝臟自身氧化和分泌的能力，在肝臟積累形成脂肪肝，泌乳早期超過50%的奶牛會(huì)出現(xiàn)甘油三脂（Triacylglycerol，TAG）積累，30%～40%的奶牛患有中度脂肪肝，5%～10%的奶牛患有重度脂肪肝[4]。

健康情況下，TAG被肝臟水解，或者通過將TAG轉(zhuǎn)化為極低密度脂蛋白（Very Low Density Lipoprotein，VLDL）的形式排出肝臟，VLDL是轉(zhuǎn)運(yùn)TAG的主要方式。患脂肪肝的奶牛，機(jī)體將肝臟無法代謝分泌排出體外的多余脂質(zhì)，以TAG的形式貯存在肝臟中，脂質(zhì)積累導(dǎo)致肝臟代謝能力下降。脂肪肝奶牛體內(nèi)VLDL合成減少，TAG無法及時(shí)排出肝臟，在肝臟內(nèi)形成脂質(zhì)積累。反芻動(dòng)物與非反芻動(dòng)物相比，脂肪肝發(fā)病率更高，可能與VLDL合成速度低有關(guān)。

脂肪肝患病早期，奶牛會(huì)出現(xiàn)食欲不振，體重減輕，產(chǎn)奶量下降，尿酮濃度升高等癥狀，嚴(yán)重時(shí)肝腎衰竭或心臟驟停。脂肪肝經(jīng)常伴隨其他肝臟疾病發(fā)生，與機(jī)體各組織器官密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，脂肪肝導(dǎo)致高產(chǎn)奶牛后續(xù)受孕率降低，機(jī)體出現(xiàn)炎癥和潰瘍，分娩間隔時(shí)間延長(zhǎng)，顯著影響生殖性能，嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致心肌炎，腎臟、卵巢、子宮和肌肉組織的壞死。

1.3 酮病與脂肪肝的關(guān)聯(lián)

酮病和脂肪肝的發(fā)生都與代謝紊亂形成的NEB有關(guān)[5]。代謝紊亂導(dǎo)致機(jī)體生成高濃度的非酯化脂肪酸（NEFAs）和β-羥基丁酸（β-hydroxybutyrate，BHBA），增大肝臟負(fù)擔(dān)，導(dǎo)致肝臟脂質(zhì)積累，肝臟是機(jī)體代謝的重要場(chǎng)所，肝臟疾病影響糖異生過程，繼而誘發(fā)酮病和脂肪肝，酮病產(chǎn)生的NEFA損傷肝臟，脂肪肝被認(rèn)為是酮病的征兆[6]，二者相互作用。與健康奶牛相比，患有代謝疾病的奶牛共發(fā)現(xiàn)524 個(gè)肝臟基因表達(dá)差異顯著，其中10%與新陳代謝有關(guān)，脂質(zhì)代謝和糖異生的關(guān)鍵基因顯著上調(diào)[4]。兩種疾病通過不同的機(jī)制，損傷奶牛肝臟，對(duì)器官組織產(chǎn)生不可逆的損傷。

2 代謝紊亂損傷雌性動(dòng)物生殖機(jī)能

隨著動(dòng)物營養(yǎng)科學(xué)及遺傳育種研究快速發(fā)展，奶牛產(chǎn)奶量及奶品質(zhì)大幅度提高。其繁殖性能在近五十年中并未隨著科技的進(jìn)步而增加，甚至還有所下降。近期研究表明，高產(chǎn)奶牛代謝紊亂疾病是奶牛繁殖性能降低的主要原因之一[7]。

發(fā)生酮病或脂肪肝的奶牛，血液中NEFA、BHBA、乙酰乙酸（Acetoxyacetic Acid，AcAc）、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶（γ-GTP）等物質(zhì)的濃度會(huì)隨著機(jī)體代謝的變化而升高[8]。酮病奶牛血液中NEFA濃度超過1. 0 mmol /L，被用作檢測(cè)代謝類疾病的指標(biāo)。NEFA本身具有脂毒性，產(chǎn)生ROS引發(fā)氧化應(yīng)激，損傷機(jī)體[9]，同時(shí)影響內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力發(fā)生變化，增加機(jī)體內(nèi)細(xì)胞凋亡[10]。NEFA或其相應(yīng)的酰基輔酶A能夠通過結(jié)合特定受體直接改變信號(hào)傳導(dǎo)途徑，或改變蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能，間接改變信號(hào)傳導(dǎo)途徑。NEFA激活TLR-4和MAPK途徑，啟動(dòng)NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)途徑，增大細(xì)胞炎癥反應(yīng)[3]。肝病奶牛體內(nèi)的卵母細(xì)胞質(zhì)量和發(fā)育潛力顯著低于健康奶牛[11]，高濃度的BHBA和葡萄糖損傷卵母細(xì)胞成熟和胚胎發(fā)育潛力[12]，高濃度的BHBA和γ-GTP抑制牛卵母細(xì)胞MII期發(fā)育[13]。

代謝紊亂引起激素分泌發(fā)生變化。NEB動(dòng)員脂肪分解，直接抑制促性腺激素釋放激素（GnRH）的分泌，同時(shí)影響促卵泡素（FSH）、黃體生成素（LH）、雌激素（E2）、孕酮（P4）、瘦素（Leptin）等分泌[14]。卵巢排卵過程受到抑制，優(yōu)勢(shì)卵泡無法及時(shí)排出，形成卵泡囊腫，引起卵巢發(fā)生病變。酮病奶牛體內(nèi)胰島素含量較低，胰島素具有刺激牛卵泡細(xì)胞發(fā)育的功能[15]，肝病奶牛卵泡液中生長(zhǎng)因子濃度較低[16]，多種因素共同影響機(jī)體無法順利發(fā)情，卵泡和輸卵管中卵母細(xì)胞和早期胚胎發(fā)育受阻，最終不僅導(dǎo)致奶牛妊娠率減低，流產(chǎn)率升高[17]，而且可能出現(xiàn)子宮機(jī)能減退等現(xiàn)象。

肝臟脂質(zhì)積累會(huì)增加機(jī)體對(duì)炎癥刺激的敏感性，使奶牛患病率增加，容易形成肝炎。肝臟的變化導(dǎo)致GHR-1A（GH受體），IGF-I，IGFBP 3、4、5、6（多種IGF結(jié)合蛋白）和胰島素樣生長(zhǎng)因子酸不穩(wěn)定亞基（Insulin-like growth factor acid-labile subunit，IGFALS）的濃度降低，IGFBP-2增加，導(dǎo)致IGF-I的循環(huán)濃度和半衰期顯著下降，卵泡成熟受阻，雌二醇的合成能力降低，排卵延遲。

代謝紊亂使免疫細(xì)胞受到過氧化反應(yīng)損傷，免疫功能降低[18]。體內(nèi)和體外的實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)高濃度的NEFA損傷免疫細(xì)胞，免疫球蛋白G（IgG）、免疫球蛋白M（IgM）和外周血單核細(xì)胞γ-干擾素（IFN-γ）[19]受NEFA影響降低。BHBA增多，白細(xì)胞數(shù)量減少，免疫細(xì)胞功能隨之下降[20]。機(jī)體免疫力低下，更易患感染性疾病，如乳房炎和子宮炎，炎癥抑制胚胎發(fā)育，影響產(chǎn)犢后子宮修復(fù)[4]。

3 褪黑素與營養(yǎng)代謝疾病

褪黑素（MLT，n-乙酰-5-甲氧基色胺）是一種主要由松果體分泌的吲哚類激素。在哺乳動(dòng)物中，色氨酸轉(zhuǎn)化為5-羥色胺，AANAT將5-羥色胺轉(zhuǎn)化為n-乙酰-5-羥色胺，經(jīng)過HIOMT的催化，最終生成褪黑素。

光線和視覺影響交感神經(jīng)支配褪黑素合成。光照強(qiáng)度變化刺激視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞去極化，經(jīng)視神經(jīng)刺激下丘腦視交叉上核，下丘腦視交叉上核通過突觸后神經(jīng)節(jié)網(wǎng)釋放腎上腺素，作用于松果體。松果體調(diào)節(jié)AANAT酶的表達(dá)和活性，調(diào)節(jié)褪黑素合成與分泌。脊椎動(dòng)物血液中的褪黑素水平有明顯的晝夜節(jié)律性，夜間水平較高，日間分泌較低[21]。

已知兩種褪黑素受體為褪黑素膜受體（MMR）和褪黑素核受體（MNR），其中褪黑素膜受體分為MT1、MT2和MT3三種。MTl和MT2都是G蛋白耦聯(lián)受體，廣泛分布于神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)和生殖系統(tǒng)[22]。MT3屬于還原酶家族，存在哺乳動(dòng)物各種組織和器官中[23]，與其他親水性或親脂性抗氧化劑相比，褪黑素的兩親性使它更容易穿過所有形態(tài)生理障礙，可以保護(hù)整個(gè)細(xì)胞免受氧化損傷[24]。褪黑素獨(dú)特的生理特性使其在代謝紊亂的調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要的作用。

3.1 褪黑素緩解代謝紊亂

褪黑素緩解代謝紊亂主要與褪黑素保護(hù)肝臟的功能有關(guān)。肝臟是人體主要代謝器官，作為機(jī)體的中轉(zhuǎn)站，在糖、脂、蛋白質(zhì)和氨基酸代謝中起重要作用。在妊娠和哺乳時(shí)期，機(jī)體需要大量的能量和營養(yǎng)，能量需求的變化使肝臟負(fù)擔(dān)增加，此時(shí)肝臟易發(fā)生病變[25]。

褪黑素強(qiáng)大的抗氧化功能保護(hù)肝臟，直接清除自由基，包括O-，H2O2，OH，ROO，1O2，NO，ONOO-等多種自由基；激活抗氧化酶，提高抗氧化酶活性及基因表達(dá)[26]。增強(qiáng)其他抗氧化劑活性[27]，保護(hù)抗氧化酶免受氧化損傷[28]。谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、谷胱甘肽還原酶（GSH-Rd）、過氧化氫酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（G6PD）[29，30]等活性和表達(dá)量都提高；減少有害物質(zhì)產(chǎn)生，如丙二醛（M D A）和次氯酸（H y p o c h l o r o u s a c i d）減少[31]；抑制增加氧化應(yīng)激酶的活性和相關(guān)基因的表達(dá)，如一氧化氮合酶（NOs）[32]、黃嘌呤氧化酶（XO）的活性和表達(dá)量降低，下調(diào)HO-1基因的表達(dá)。褪黑素具有降血脂的功能，促進(jìn)膽固醇轉(zhuǎn)化為膽汁酸，抑制膽固醇合成和受體的活性。體內(nèi)的總膽固醇（TC）、甘油三脂（TG）和低密度脂蛋白膽固醇（LDL-c）減少，高密度脂蛋白膽固醇（HDL-c）增多；褪黑素具有抗炎性，可以減少促炎細(xì)胞因子，如白細(xì)胞介素-1（IL-1β）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（TGF-β）在體內(nèi)含量減少，自然殺傷細(xì)胞（NK cell）增加；防止NLRP3炎性小體活化，硫氧還蛋白結(jié)合蛋白2（TXNIP）表達(dá)增加，中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)減少。抑制氨基轉(zhuǎn)移酶發(fā)揮作用，如丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）和天門冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）活性降低；線粒體氧化磷酸化反應(yīng)過程產(chǎn)生大量ROS，無法利用常規(guī)的抗氧化劑進(jìn)行清除，褪黑素獨(dú)特的雙親性保護(hù)細(xì)胞線粒體免受損傷，提高線粒體氧化磷酸化效率，減少線粒體電子漏，減少自由基生成[33]。褪黑素抑制固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白（SREBP-1c）活化，SREBP-1c靶基因下調(diào)，阻止脂多糖lps誘導(dǎo)的肝臟脂質(zhì)堆積[34]。

此外，褪黑素可以抑制雌激素缺乏和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激引起的肝臟脂肪變性。外源性褪黑素對(duì)去卵巢（OVX）大鼠肝臟脂質(zhì)積累和細(xì)胞氧化應(yīng)激均有抑制作用，褪黑素可減輕OVX大鼠肝臟脂肪變性和細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷[35]。microRNA（miRNA）是基因調(diào)控的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，miRNA功能障礙是代謝疾病的共同特征，miR-23a調(diào)節(jié)ER應(yīng)激。褪黑素緩解衣霉素誘導(dǎo)的脂質(zhì)積累，通過控制miR-23a表達(dá)機(jī)制和Ca2+穩(wěn)態(tài)，降低肝細(xì)胞的ER應(yīng)激，在改善ER應(yīng)激誘導(dǎo)的肝脂肪變性和炎癥中起關(guān)鍵作用，可用作藥理學(xué)試劑保護(hù)肝免受ER應(yīng)激誘導(dǎo)的代謝功能障礙[36]。

3.2 褪黑素參與代謝節(jié)律性調(diào)節(jié)

機(jī)體代謝受到晝夜節(jié)律的調(diào)控，機(jī)體生物鐘通過調(diào)節(jié)代謝關(guān)鍵步驟和反應(yīng)底物，實(shí)現(xiàn)代謝途徑的時(shí)間調(diào)節(jié)。目前已知的生物節(jié)律調(diào)節(jié)因子有去乙酰化酶（SIRT1）和單磷酸腺苷活化蛋白激酶（AMPK）。兩者與生物鐘機(jī)制聯(lián)合作用，參與哺乳動(dòng)物生理代謝與生物節(jié)律調(diào)節(jié)。褪黑素連接光周期和機(jī)體內(nèi)各種節(jié)律，參與調(diào)節(jié)機(jī)體節(jié)律性[37]，并且可以改善由于晝夜節(jié)律紊亂造成的能量代謝變化[38]。另外，褪黑素的晝夜節(jié)律性參與調(diào)節(jié)生殖活動(dòng)，主要通過調(diào)節(jié)性腺軸改善機(jī)體生殖的功能，改善卵巢功能和卵泡發(fā)育，在后期繼續(xù)影響胎兒發(fā)育[39]。

3.3 褪黑素增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能

褪黑素作用于免疫細(xì)胞，促進(jìn)抗體生成，提高機(jī)體對(duì)抗體敏感性，增強(qiáng)抗體作用。褪黑素作用于淋巴細(xì)胞，促進(jìn)淋巴因子釋放，提高免疫成分活性，促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖，增加免疫器官重量[40]。針對(duì)病毒和寄生蟲等外部應(yīng)激原，褪黑素使尚未激活的免疫系統(tǒng)提前進(jìn)入興奮狀態(tài)，實(shí)現(xiàn)早期免疫應(yīng)答；對(duì)于短期或慢性免疫反應(yīng)，如敗血癥性休克，褪黑素一方面進(jìn)行負(fù)反饋調(diào)節(jié)，一方面作為抗炎因子發(fā)揮作用。褪黑素對(duì)于免疫系統(tǒng)多效、多樣和復(fù)雜的作用，被形象的稱為“免疫緩沖液”[41]。

3.4 褪黑素減少代謝紊亂產(chǎn)生的并發(fā)癥

褪黑素作用到患病機(jī)體，有效控制疾病損傷，緩解代謝紊亂產(chǎn)生的并發(fā)癥，加快機(jī)體恢復(fù)[38]。褪黑素減輕乳房炎對(duì)奶牛的傷害，降低牛奶體細(xì)胞數(shù)，緩解乳房炎癥狀，促進(jìn)奶牛乳房恢復(fù)健康[42]。褪黑素緩解代謝紊亂造成的奶牛雌性繁殖障礙，長(zhǎng)期改善小鼠、豬、牛、綿羊等卵母細(xì)胞和胚胎發(fā)育，改善線粒體功能，延緩卵巢的衰老，調(diào)節(jié)胚胎新陳代謝，促進(jìn)胚泡形成。褪黑素作用于黃體細(xì)胞，刺激P4分泌，增加小鼠胚胎附植點(diǎn)數(shù)以及產(chǎn)仔數(shù)。促進(jìn)子宮在胚胎附植的過程中形成接受態(tài)，利于胚胎正常發(fā)育，在胚胎早期植入過程中發(fā)揮重要作用。褪黑素穿過生理屏障作用于胎盤，減少氧化應(yīng)激對(duì)胎盤的損傷，降低牛的流產(chǎn)率。

4 展望

代謝類疾病對(duì)奶牛養(yǎng)殖行業(yè)造成巨大損失，多年來，一直積極尋求治療奶牛代謝疾病的方法，既要安全有效，又要符合市場(chǎng)對(duì)于成本的預(yù)期。褪黑素的生理功能有利于解決奶牛養(yǎng)殖行業(yè)諸多問題，其獨(dú)特的功效為中國乳業(yè)開發(fā)新產(chǎn)品提供了思路，其對(duì)于奶牛生殖和免疫方面的積極作用已經(jīng)得到證實(shí)，對(duì)于代謝紊亂的調(diào)節(jié)作用也在多個(gè)物種上得到驗(yàn)證，關(guān)于褪黑素與代謝的具體作用機(jī)制依然是研究的熱點(diǎn)，緩解奶牛代謝疾病的藥用價(jià)值還有待進(jìn)一步研究。C