ELISA法檢測油菜籽中的黃曲霉毒素B1

楊權 孫婷琳 王燕 余佳 李利霞 熊英

摘 要：為了建立油菜籽中黃曲霉毒素B1（Aflatoxin B1，AFB1）的快速檢測方法，本文采用酶聯免疫吸附法，選取不同濃度的提取液、不同種類、不同比例的稀釋液檢測樣本的加標回收率，并進行了準確度、精密度及重復性的評價。結果發現用60%甲醇1︰5、超純水1︰4稀釋檢測油菜籽樣本中黃曲霉毒素B1的加標回收率為99%～106%，相對標準偏差小于5%。結果表明，酶聯免疫吸附法測定油菜籽中黃曲霉毒素B1含量的準確性，重現性，穩定性好，可廣泛用于油菜籽中黃曲霉毒素B1的檢測。

關鍵詞：AFB1;酶聯免疫吸附法;油菜籽

黃曲霉毒素是一組真菌（霉菌）毒素，是黃曲霉和寄生曲霉的代謝產物[1]，廣泛存在于花生、大豆等農產品中，是影響花生、大豆、芝麻等農產品油料質量安全的重要因素。黃曲霉毒素具有毒性和強致癌性，毒性遠遠高于氰化物、砷化物和有機農藥的毒性[2]。其中黃曲霉毒素B1是目前已知致癌性最強的天然毒素，對人及動物肝臟組織有破壞作用，人、畜攝入了黃曲霉毒素超標的食物或飼料，可發生急性中毒，出現急性肝炎、出血性壞死、肝細胞脂肪變性和膽管增生。當微量持續攝入，可造成慢性中毒，出現肝實質細胞變性、肝硬化等，動物生長發育遲緩，體重減輕，母畜不孕或產仔少等系列癥狀，可誘發肝癌、胃癌等多種部位的癌癥。目前黃曲霉毒素的常規檢測方法有薄層色譜法、高效液相色譜法、高效液相色譜-串聯質譜法及酶聯免疫吸附

法等[3-4]。

油菜是我國傳統的油料作物，也是我國主要的油料作物。菜籽油一直是我國居民的傳統生活用油，在我國植物油供給結構中，菜籽油居第二位[5]。在菜籽油實際生產中，往往會由油菜籽中引入黃曲霉毒素B1，導致成品菜籽油中可能會含有微量黃曲霉毒素B1。在檢測黃曲霉毒素B1的不同方法中，酶聯免疫吸附法（ELISA）由于其具有快速、靈敏、準確、操作相對簡單，無需昂貴的大型儀器等優點，適用于油菜籽批量篩查檢驗。本文擬采用ELISA法檢測油菜籽中的黃曲霉毒素B1含量，并選取合適的試驗條件。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

甲醇（分析純，國藥集團）;乙腈（色譜純，國藥集團）;磷酸氫二鈉（分析純，國藥集團）;磷酸二氫鈉（分析純，國藥集團）;氯化鈉（分析純，國藥集團）;超純水;HF4500酶標儀（美正集團生物科技有限公司）;高速離心機（湘儀H1850）;電子天平（梅特勒-托利多）;液相色譜（島津LC-20AT）。

油菜籽樣本，孝感市孝南區種植收獲采集。黃曲霉毒素B1標準品;黃曲霉毒素B1ELISA檢測試劑盒（北京華安麥科生物有限公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 油菜籽樣品前處理

采用60%、70%、80%、90%的甲醇-水作為樣本提取液，提取步驟為將油菜籽樣品混合均勻并粉碎（廣州市旭朗機械多功能切碎機，10～80目），稱取5.0 g經粉碎的油菜籽樣品，加入25.0 mL上述不同濃度的提取液，在振蕩器上振搖10.0 min（轉速為200 r/min），然后在4 000 r/min條件下離心5.0 min，過濾取濾液1 mL，再分別加入4 mL、5 mL、9 mL不同體積的水和0.01 M磷酸鹽緩沖液進行稀釋（即1︰4、1︰5、1︰9稀釋），即為樣本待測液。

1.2.2 ELISA試劑盒檢測樣本中AFB1

將酶聯免疫試劑盒從冷藏環境中取出，置于室溫（20～25 ℃）平衡30 min，取出微孔板，將樣本和標準品對應微孔按序編號，并記錄標準孔盒樣本孔所在的位置;根據產品操作流程分別加入標準品或樣本50 μL到對應的微孔中，加入AFB1酶標物50 μL/孔，最后再加入AFB1試劑

50 μL/孔，用手輕敲震蕩混勻，用避光膜蓋住板，置室溫環境中反應30 min;反應時間結束后，小心揭開膜，將微孔內液體甩干，用試劑盒中提供的洗滌液300 μL/孔，充分洗滌5次，每次間隔10 S，然后在吸水紙上拍干;加入底物顯色液100 μL/孔，輕敲震蕩混勻，用避光膜蓋好，置室溫環境反應15 min;反應時間結束，加入終止液50 μL/孔，輕輕震蕩混勻，設定酶標儀波長A450/A630處測定每孔OD值。

1.3 定量分析方法

采用試劑盒專用的分析軟件對結果進行分析，該試劑盒標示靈敏度為0.03 μg/kg，變異系數小于10%。最終檢測結果應以實際測定的吸光度，并將對應的稀釋倍數換算后計算得出。

2 結果與分析

2.1 油菜籽樣本中AFB1的含量

選取5個同一批次，不同區域的樣本，用高效液相色譜法GB 5009.22—2016檢測其黃曲霉毒素B1含量，結果如表1所示。所測定的5個樣品中，有兩個油菜籽樣品未檢出AFB1，其他3個樣品均有檢出，分別為1.14 μg/kg、0.5 μg/kg、0.15 μg/kg，都未超過國家標準10 μg/kg。因此，本實驗以未檢出AFB1的油菜籽1為樣本，以空白為基底，加標檢驗回收。

2.2 提取溶劑的選擇

分別用60%、70%、80%、90%四種濃度的甲醇-水作為提取液對油菜籽樣本進行提取（料液比=1︰5，即5.0 g樣本中加入25.0 mL提取液），1︰4水稀釋，得到AFB1加標回收率的結果如表1所示（每個加標平行測定3次）。由表1可知，60%甲醇-水提取液對樣本的提取效果較為理想，回收率為103.2%。考慮高含量有機試劑對環境及操作人員危害性，及高濃度的甲醇可能會對抗原和抗體的結合產生抑制作用，造成結果的不準確。綜合選取60%濃度的甲醇-水提取液為最佳提取溶劑。

2.3 稀釋方法的選擇

查閱文獻可知，提取比例在1︰5時有足夠的提取效率，且可得到足夠的上清液。固提取比例固定在1︰5，選取不同的稀釋比例及稀釋液進行優化。由于檢出限不能過高，選體積比為1︰4、1︰5、1︰9的不同稀釋比例，稀釋液分別采用超純水和0.01 M PBS。結果如表2所示，當提取比例為1︰5，水為稀釋液時，稀釋比例為1︰4、1︰5、1︰9的3種條件下的回收率分別為104%、110%、96%，都在可接受范圍內，且檢出限滿足要求。當稀釋比例為1︰4、1︰5、1︰9，稀釋倍數分別是25倍、30倍、50倍，綜合考慮檢出限及回收率，1︰4的稀釋比例更為合適，該方法的倍數為25倍。當0.01 MPBS作為稀釋液時，無論何種稀釋比例，回收均偏高，且出現假陽性的現象，因此確定該稀釋液不適用。

2.4 實際樣本的檢測

將樣本按曲線點添加0 μg/kg、0.75 μg/kg、3 μg/kg、12 μg/kg、50 μg/kg AFB1標準溶液，按照上述60%甲醇1︰5提取，超純水1︰4稀釋，測定樣本中AFB1含量，計算回收率，每個濃度測定3次平行。結果如表4所示，回收率在91%～106%，平均回收率為100%。說明60%甲醇1︰5提取，超純水1︰4稀釋測定樣本中AFB1含量的準確率高，穩定性較好，完全滿足日常監測的需求。

3 展望

傳統的酶聯免疫方法，利用抗原和抗體結合的原理實現了多種樣本的檢測，隨著人們研究的深入在逐漸擴大，一些特殊樣本的檢測靈敏度甚至超過了儀器方法。當然在生活水平日益提高的同時，人們對食品安全的關注也越來越高，對不同樣本的檢測方法提出了更高的要求，例如更便捷、更靈敏、更快速等。目前一些技術在市場上已經有所體現，例如微陣列芯片、電化學傳感器、化學發光、微流控、免疫熒光等各種技術都在食品安全檢測行業有應用。本文開發的油菜籽方法，在技術上達到其中黃曲霉毒素B1檢驗的要求，具有高準確度、高精密度、安全性好、快速的特點。為該類樣本的檢測提供了一個前期基礎，希望在未來能夠實現更高效、高靈敏的檢測。

參考文獻

[1]李江，李曉明，綦艷，等.酶聯免疫法檢測醬油中的黃曲霉毒素B1[J].食品安全質量檢測學報，2016（12）：5.

[2]李培武，馬良，楊金娥，等.糧油產品黃曲黃曲霉毒素B1檢測技術研究進展[J].中國油料作物學報，2014，36（3）：404-408.

[3]李少暉，任丹丹，謝云峰，等.食品中黃曲霉毒素檢測方法研究進展[J].食品安全質量檢測學報，2015（4）：1107-1115.

[4]蔡正森，鐘文輝，張東升，等.ELISA法和HPLC法檢測糧油食品中黃曲霉毒素B1含量的比較研究[J].中國衛生檢驗雜志，2004，14（3）：302-304.

[5]陳靜.湖北省油菜產業發展問題研究[D].武漢：華中農業大學，2014.