發(fā)酵法生產氨基酸工藝研究

魯佩玉，孫青華

(青島科技大學 化工學院，山東 青島 266000)

氨基酸在工業(yè)生產中應用十分廣泛，例如動物飼料添加劑、人類食物調味品以及化妝品和醫(yī)療產品的原料。氨基酸是生物體中蛋白質的組成模塊，對生物體的代謝途徑和代謝方式起調節(jié)作用[1]，是生命體的重要組成部分，氨基酸缺乏會導致人類和動物患病[2]。

自1907年開始生產谷氨酸鈉(MSG)以來，氨基酸的市場需求逐年增加。據(jù)統(tǒng)計，2008年氨基酸市場總額約54億美元[3]，預計到2018年底將超過94億美元。然而，生產氨基酸的工業(yè)技術仍不完善，需要進一步的優(yōu)化。出于這個原因，許多公司和學術機構開始在該領域進行研究，目的是尋找更經濟、更環(huán)保的氨基酸生產途徑。

氨基酸可以通過不同的方法生產，例如從蛋白質水解產物中提取、化學合成、酶促和發(fā)酵途徑。目前工業(yè)上生產的氨基酸大多是通過發(fā)酵途徑來實現(xiàn)的，在需氧或厭氧條件下，利用一種或幾種微生物將底物中存在的糖類轉化為廣譜氨基酸，該方法與其他方法相比，具有較大優(yōu)勢。首先，發(fā)酵法生產的氨基酸對映體純度較高，減少了后續(xù)的純化步驟；其次，發(fā)酵過程在相對溫和的條件下進行，能夠防止產品進一步降解[4]，且成本較酶促法顯著降低，但是發(fā)酵過程中需要維持無菌環(huán)境，攪拌以及補料都會增加資金投入[5]。

選擇最優(yōu)的氨基酸生產方法，需要參考眾多標準，綜合分析，如可用技術和資本投資、產品市場規(guī)模和收入、原材料和運營成本以及每個特定過程的環(huán)境影響。然而，由于發(fā)酵法的經濟優(yōu)勢和環(huán)保優(yōu)勢，現(xiàn)已成為工業(yè)化規(guī)模生產氨基酸最常用的方法。

本文討論了發(fā)酵工藝參數(shù)、與工業(yè)氨基酸生產相關的技術問題以及可能的改進方案，為氨基酸工業(yè)的進一步發(fā)展提供了技術支撐。

1 氨基酸生產中的工藝設計

1.1 過程監(jiān)控

在發(fā)酵過程中，需要持續(xù)監(jiān)測關鍵參數(shù)和過程變量，如接種物質量、pH、進料速率、通氣流量和過程溫度[6]。Villadsen等證明發(fā)酵過程中通氣流量(OTR)能夠顯著影響氨基酸產率[7]，增加OTR能夠使L-苯丙氨酸產率提高45%，而OTR增加卻不利于L-色氨酸的生產，可見發(fā)酵過程中控制OTR意義重大。準確監(jiān)控和調整產率還必須仔細選擇恰當?shù)墓に嚋囟龋瑢劝彼岚魻顥U菌的研究顯示，高溫(高達41 ℃)可以提高某些氨基酸如L-谷氨酸的產量[8]。人們還研究了耐高溫細菌，例如甲醇芽孢桿菌，其可在高達50 ℃的溫度下產生L-賴氨酸和L-谷氨酸[9]，這些耐高溫細菌不僅可以增加目標產物的產率，還能夠減少發(fā)酵過程中冷卻水用量，進一步節(jié)約成本，提高經濟效益。此外，發(fā)酵種子液制備是發(fā)酵過程中的關鍵步驟，因為它可以顯著影響菌株的生產力和氨基酸產量。因此，為了確保種子液中菌株的最佳狀態(tài)，菌株的穩(wěn)定性和生產力應在轉移到主發(fā)酵罐之前進行徹底測試。

1.2 分批補料

氨基酸工業(yè)中最常用的反應器操作模式是分批補料操作。該過程初始僅需要少量培養(yǎng)基和接種物，開發(fā)出預定的進料曲線，獲得更高的產率或產量之后，再將碳源按進料曲線加入到反應器中。在此過程中，細胞和產物都保留在反應器中，發(fā)酵所需的營養(yǎng)物，如硫酸銨或純氨、生物素、其他維生素，由最初的接種物提供。該模式確保了反應器中充足的氧氣容量，以滿足微生物的氧氣需求，從而減少由于氧氣限制而形成的副產物，更好地控制營養(yǎng)物的濃度，從而提高氨基酸的產率和產量。Abou-taleb等分別采用分批投料與一次性投料的方式對芽孢桿菌進行發(fā)酵，并進行對比[10]，實驗證明，分批補料工藝的總氨基酸濃度比一次性投料工藝高出近1倍。盡管一次性投料在過程控制和技術方面相對簡單，但與分批補料操作相比，一次性投料產率和重現(xiàn)性均較低，而分批補料操作不僅增加了發(fā)酵的過程性能，而且提高了發(fā)酵初始含碳量，降低了底物或產物抑制的風險。

1.3 連續(xù)生產

連續(xù)生產的操作模式可以提供比分批補料模式高2.5倍的氨基酸產率和過程輸出[11]。然而，連續(xù)生產也存在著一定的弊端，連續(xù)的流入和流出，增加了反應器受污染的風險，發(fā)酵環(huán)境的連續(xù)改變還可能會引起菌株退化。Koyoma等以連續(xù)發(fā)酵的方式利用乳酸短桿菌生產L-谷氨酸，并與間歇法進行對比，實驗發(fā)現(xiàn)連續(xù)發(fā)酵法較間歇法的L-谷氨酸產量高出1倍[12]。

此外，為了改善連續(xù)生產的性能，可以將多個生物過程串聯(lián)。微生物的生長階段可以在生產過程以外的反應器中進行，因而可以對2個階段分別進行優(yōu)化，此外，高生長速率可以縮短發(fā)酵時間，一定程度上可以縮小反應器的規(guī)模，增加輸出。

1.4 下游分離純化

有效的下游純化方法對于降低氨基酸生產成本至關重要。通常采用離心和過濾的方法從發(fā)酵液中初步分離氨基酸，再根據(jù)目標氨基酸的性質，例如溶解度、等電點和吸附性等，選擇合適的色譜方法進一步分離純化。然而，由于純化階段所需步驟眾多，每一步都不可避免而造成目標產物的損失，這也勢必造成高純度氨基酸生產成本提高。

由于膜工藝的高選擇性和低熱輸入優(yōu)勢，引起了人們越來越多的關注，最常見的用于分離目標氨基酸的膜分離方法是離子交換膜[13]。為了進一步提高過程性能、降低成本，人們還研究了新的膜過濾方法，其中納濾是壓力驅動的膜過濾方法中的一種創(chuàng)新技術[14]。這些膜可以很容易地與傳統(tǒng)發(fā)酵罐結合，在同一運營單元中將生產和凈化相結合，從而減少資本投資。

1.5 流程建模與分析

氨基酸發(fā)酵工業(yè)的另一個關鍵因素是工藝放大。在規(guī)模較大的反應器中不同的幾何和物理條件，可能會影響發(fā)酵的重要參數(shù)，從而導致工藝穩(wěn)定性、重現(xiàn)性、產率降低，還可能引入更多的副產物，為后續(xù)純化增加困難，影響產品質量。尤其是在工業(yè)生產中，微生物發(fā)酵過程常常受原料混合效率的影響，較低的混合效率與微生物細胞較高的代謝活性相結合，導致生物反應器中形成局部濃度梯度[15]，對氨基酸生產造成不利影響，而反應器尺寸增加使這個問題更加復雜。傳統(tǒng)的發(fā)酵罐設計通常是將底物從發(fā)酵罐頂部供給，而氣體則從底部供給，底物和氧的濃度梯度沿著反應器高度遵循相反的變化趨勢。在工業(yè)發(fā)酵罐中，由于發(fā)酵罐高度增加，促使底物與氧的濃度梯度更明顯，產生更大的底物和氧耗盡區(qū)，并且發(fā)酵罐內培養(yǎng)液體積增大，更強的水壓梯度會影響氧轉移速率，并且使混勻時間延長，這使得發(fā)酵罐頂部的微生物同時暴露于高糖濃度和低氧濃度下，而在底部微生物則暴露于低糖濃度和高氧濃度下[16]。反應器中處于高糖濃度和低氧濃度環(huán)境下的微生物會生產大量乙酸鹽、乙醇、乳酸鹽、氫氣、琥珀酸鹽和甲酸鹽，這些酸產物會導致培養(yǎng)基酸化，再與攪拌產生的過量熱一起誘導形成一定的壓力區(qū)域，使該環(huán)境下的微生物不能更好地發(fā)揮作用。為了研究這些參數(shù)對工業(yè)過程的影響，已經應用了諸如計算流體動力學(CFD)和設備小試的方法來進行優(yōu)化。

1.5.1 縮小設備

縮小反應器進行設備小試，作為模仿大規(guī)模生物反應器條件的工具用來預測產量和產率的變化，受到人們越來越多的關注。雙攪拌釜反應器或推流式反應器是最常見的反應器類型，實驗室中常利用這些設備來提供攪拌條件，從而選擇更穩(wěn)定的菌株，增強從小規(guī)模到更大規(guī)模的可轉移性[17]。為了獲得大規(guī)模反應器的最佳性能預測模型，縮小規(guī)模必須根據(jù)工業(yè)過程的相應條件進行適當?shù)恼{整[18]。

1.5.2 流程建模

根據(jù)發(fā)酵工藝操作參數(shù)，工藝化學計量和環(huán)境因素的模型[19]，流程建模可以協(xié)助整個發(fā)酵過程中各個流程的設計和優(yōu)化，推算出工藝效率，產物滴度，選擇性以及最佳產率條件。此外，還可以通過計算流體動力學方法得到流體混合的抽象數(shù)學模型，以Reynolds平均的三維Navier-Stokes方程為基礎,采用Eulerian-Eulerian法模擬工業(yè)規(guī)模生物反應器中流體的湍流特性[20]，最終可以得到有關流體速度，溫度以及整個反應器中濃度分布的詳細信息。

將模型獲得的結果與按比例縮小設備獲得的數(shù)據(jù)相結合，可以在開發(fā)的早期階段確定最佳過程配置，幫助優(yōu)化現(xiàn)有流程，協(xié)助新工藝開發(fā)。這種流程建模的方法盡管在計算領域已經進行了多項研究，但還需要更好的模擬器來支持反應器進一步放大。

1.5.3 過程強化

過程強化(PI)是提高氨基酸發(fā)酵產率的另一個重要方法，可以使發(fā)酵過程更安全、更潔凈、更節(jié)能[21]。過程強化可以通過2種方法來實現(xiàn)：一種是增強設備，例如新反應器，熱交換器或傳質單元；另一種是使用創(chuàng)新的分離方法或技術來強化過程本身[22]，例如將反應器配置(操作模式)更改為分批補料反應器，可以使賴氨酸產率提高到一次性投料的2倍，在一次投料或補料分批操作之后，將60%或90%的最終發(fā)酵液轉移到下游，而另一部分保留在反應器中，再將反應器用新鮮培養(yǎng)基重新填充至起始工作體積，并定期開始下一次發(fā)酵。減少在系統(tǒng)中引入新接種物所需的時間和制備無菌生物反應器的停機時間，縮短發(fā)酵周期，提高氨基酸生率，工藝的經濟性顯著提高[23]。

膜分離技術是一種良好的創(chuàng)新分離方法，該方法能夠改善發(fā)酵工藝性能，實現(xiàn)特定化合物的有效運輸。電膜過濾技術已經應用于分離氨基酸，Kumar等已經利用L-谷氨酸和L-賴氨酸等電點不同以及所帶電荷相反的性質，采用電膜分離技術成功將兩種氨基酸分離，其中L-谷氨酸的回收率達到85%，這一實例證明了該技術在工業(yè)應用中具有巨大潛力。該方法可以將發(fā)酵過程與分離過程結合到同一單元操作中，從而實現(xiàn)過程強化。

2 結論

由于經濟和環(huán)境的優(yōu)勢以及基因工程技術的發(fā)展，發(fā)酵成為工業(yè)化生產氨基酸最常用的技術。優(yōu)化發(fā)酵工藝對于提高效率、減少成本至關重要，創(chuàng)新的分離技術，如納濾膜，可以整合到發(fā)酵罐中，將生產和凈化相結合。此外，能夠模仿大規(guī)模反應器的技術，如流程建模或縮小設備，可以減少反應器工業(yè)放大引起的諸多問題。因此，將流程建模、過程模擬和代謝工程工具結合起來，可以在過程設計早期開發(fā)階段得到最佳工藝參數(shù)，從而最大限度地減少工藝過程的不確定性。