甲狀腺乳頭狀癌組織中ZNF703、CD44v6的表達及與臨床病理參數的相關性

徐振宇 白文忠 李廣平

(唐山市工人醫院 1醫務科,河北 唐山 063000;2耳鼻喉科;3檢驗科)

甲狀腺癌是一種常見的內分泌器官惡性腫瘤，甲狀腺乳頭狀癌是甲狀腺癌中最常見的一種類型〔1〕，約占甲狀腺癌的70%，在我國沿海及高碘攝入地區，其比例已達90%以上〔2〕，并且甲狀腺乳頭狀癌發病率呈明顯上升趨勢〔3，4〕。鋅指蛋白(ZNF)703基因位于染色體8區域〔5〕。國內外許多研究發現ZNF703在人大腸癌、肺癌、乳腺癌、胃癌等腫瘤中均有較高水平表達〔6～9〕，發揮致癌作用，且ZNF703高表達提示預后較差。CD44v6是一種細胞表面跨膜糖蛋白，其出現會使腫瘤細胞表面黏附分子的結構和功能改變，導致腫瘤細胞侵襲和轉移能力增強。甲狀腺乳頭狀癌早期可能發生頸部淋巴結轉移，現有的影像學方法較難發現早期頸部淋巴結轉移癌，待其發展至影像學可見，多已突破淋巴結包膜，此時療效及預后均會有所降低。關于ZNF703和CD44v6在甲狀腺乳頭狀癌中表達水平的報道較少，因此本研究檢測甲狀腺乳頭狀癌組織中ZNF703和CD44v6的表達水平及與臨床特征的相關性。

1 材料與方法

1.1研究對象 選取2016年12月至2018年2月唐山市工人醫院行甲狀腺切除術患者的手術標本，甲狀腺乳頭狀癌組織73例、配對癌旁正常甲狀腺組織73例(取材處距離癌組織邊緣≥5 cm，術后病理確認為正常組織)、結節性甲狀腺瘤組織50例甲狀腺乳頭狀癌組26例男性，47例女性，平均年齡(56.36±9.84)歲，腫瘤直徑≤4 cm者 42例，直徑>4 cm者31例；淋巴結轉移者32例，無淋巴結轉移者41例；依據AJCC癌癥分期手冊第七版標準〔10〕：臨床分期Ⅰ～Ⅱ期 45 例，Ⅲ～Ⅳ期28例。結節性甲狀腺癌組17例男性，33例女性，平均年齡(55.21±13.07)歲。甲狀腺乳頭狀癌組及癌旁組患者納入標準：①診斷經病理證實，符合AJCC癌癥分期手冊第七版標準〔10〕；②初次甲狀腺手術；③相關臨床資料完整。排除標準：①術前接受過放療、化療；②患有橋本甲狀腺炎及乳腺、子宮相關疾病；③有其他惡性腫瘤病史。參與本實驗的所有患者知情同意并簽署知情同意書，且獲本院倫理委員會同意。

1.2主要試劑 兔抗人抗體ZNF703購于美國Abcam公司，鼠抗人單抗CD44v6、通用型IgG、SP試劑盒、二氨基聯苯胺(DAB)顯色試劑盒均購于北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.3免疫組化過程 實驗采用鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連接(SP)法，將所有標本蠟塊切成4 μm厚，將切片置于68℃烤片機烤20 min，經二甲苯脫蠟后，梯度酒精脫水；3%過氧化氫(H2O2)孵育，磷酸鹽緩沖液(PBS)液沖洗；抗原修復；血清工作液封閉30 min后，切片分別滴加ZNF703 (1∶100)、CD44v6(1∶200)，PBS陰性對照，4℃孵育過夜；通用型IgG及DAB顯色試劑盒均參照說明書操作；脫水、干燥、封片。

1.4結果判定〔8〕ZNF703主要在細胞核及細胞質中表達，表達陽性呈棕黃色；CD44v6主要在細胞膜中表達，表達陽性呈棕黃色。每個免疫組化切片隨機選取5個100×視野，取平均值，以陽性細胞數百分比和染色反應強度兩種方法進行評分。陽性細胞數百分比≤10%為0分，10%<陽性細胞數百分比≤25%為1分，25%<陽性細胞數百分比≤50%為2分，50%<陽性細胞數百分比≤75%為3分，陽性細胞數百分比>75%為4分。陽性細胞染色強度為不顯色或顯色不清為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，深棕色為3分。取陽性細胞數百分比和染色反應強度分值的乘積，0～1分為-，2～4為+，5～8分為，9～12分為，+～為陽性表達。

1.5統計學方法 應用 SPSS21.0統計軟件進行χ2檢驗，相關分析采用Spearman等級相關。

2 結 果

2.1免疫組化染色結果 CD44v6在甲狀腺乳頭狀癌組織中ZNF703的陽性表達率顯著高于癌旁組〔9(12.32%),χ2=49.912，P=0.000〕及組織〔12例(24.00%)，χ2=24.982，P=0.000〕，CD44v6在癌組織中的陽性表達率57例(78.08%)依次高于癌旁組〔16例(21.92%)，χ2=46.055，P=0.000〕及結節性甲狀腺癌組織〔18例(36.00%)，χ2=22.085，P=0.000〕。

2.2甲狀腺乳頭狀癌組織中ZNF703和CD44v6的陽性表達率與臨床病理特征的關系 ZNF703和CD44v6在甲狀腺乳頭狀癌組織中的陽性表達率均與患者性別、年齡無顯著相關，與腫瘤直徑、臨床分期及淋巴結轉移情況顯著相關(P<0.05)，見表1。

表1 ZNF703和 CD44v6陽性表達與甲狀腺乳頭狀癌臨床病理特征的關系〔n(%)〕

2.3ZNF703和CD44v6在結節性甲狀腺癌組織中表達的相關性 Spearman等級相關的檢驗結果顯示，ZNF703和CD44v6在結節性甲狀腺癌組織中的表達呈正相關(r=0.722，P=0.000)。

3 討 論

甲狀腺乳頭狀癌組織在光學顯微鏡下為“明確的濾泡細胞分化，典型的乳頭狀及濾泡結構，特征性胞核改變的甲狀腺惡性上皮腫瘤”〔11〕。鋅指蛋白是具有指狀結構的轉錄因子，存在于真核生物中，參與細胞分化、增殖、凋亡及表達調控等生命過程〔12〕。ZNF703是新發現的鋅指蛋白一員，目前已被證實為乳腺癌致癌因子〔13〕。Yang等〔6〕發現，使用核糖核酸干擾胃癌SGC7901細胞中ZNF703的高表達可減少腫瘤細胞的增殖和遷移。ZNF703在人體多種器官發揮癌基因的作用，這提示ZNF703可能為廣譜致癌因子。ZNF703的作用機制可能與其參與細胞周期調控有關，Sircolomb等〔14〕發現 ZNF703 可以抑制轉化生長因子(TGF)-β受體活性，降低E 鈣黏蛋白的表達并上調親遷徙性P120連環亞蛋白的表達，以此促進細胞的增殖與遷移，減少細胞間的黏附作用，癌細胞的侵襲性將大幅增加。還有研究發現ZNF703可能對雌激素存在負反饋調節，ZNF703通過PI3K-AKT-mTOR經典信號通路，誘導雌激素受體(ER)α下調〔14，15〕，而ERα高表達可明顯減緩腫瘤的進展。本研究發現，ZNF703 在甲狀腺乳頭狀癌中的表達明顯高于癌旁組織和結節性甲狀腺瘤組織，且與腫瘤大小、淋巴結轉移、臨床分期有關，與患者年齡、性別無關，此結果與Wang等〔16〕和Ma等〔17〕所得研究結果一致，這說明ZNF703與甲狀腺乳頭狀癌的發生、發展過程密切相關，對確定腫瘤分期有一定價值。CD44是一種整合膜糖蛋白，可連結細胞基質中的層黏連蛋白和纖維連結蛋白，也可連接Ⅰ型膠原和透明質酸分子，還可與細胞管架蛋白相結合，從而造成細胞形態和游動性改變〔18〕，在腫瘤細胞中表達可參與腫瘤的浸潤、轉移。CD44v6是CD44的變異型，也與腫瘤細胞的遷移有關，其機制可能和參與ras信號通道的激活過程〔19〕有關。此外通過對小鼠胃癌模型研究發現，CD44v6可調節脂肪基質細胞介導的細胞外基質(ECM)重塑，從而增加胃癌惡性表型〔20〕。Gutjahr等〔21〕發現白血病B細胞上CD44v6與透明質酸具有高度親和力，可促進慢性淋巴細胞白血病的進展。本研究結果表明，CD44v6在甲狀腺乳頭狀癌中的表達明顯高于癌旁組織和結節性甲狀腺瘤組，且與腫瘤大小、淋巴結轉移、臨床分期相關，與患者年齡、性別無關，與Wu等〔22〕的研究結果相似，這提示CD44v6有鑒別甲狀腺腫瘤良、惡性的潛能，在提示預后方面也有重要的臨床價值。此外，本研究發現，在甲狀腺乳頭狀癌組織中，ZNF703與CD44v6的表達呈正相關。兩種蛋白位于細胞的不同位置，ZNF703可通過PI3K-AKT-mTOR經典信號通路產生作用〔14，15〕，誘導ERα下調，而CD44v6可參與ras信號通道激活〔19〕，通過ras基因傳遞細胞增殖信號，這兩種蛋白可能存在協同作用，其機制仍需進一步研究。