骨髓間充質干細胞移植對脊髓損傷模型大鼠Toll樣受體4表達的影響

李季 蔡錦芳 鄒林 李宗玉

(1鄭州市第一人民醫院骨外科，河南 鄭州 450004；2濟南軍區總醫院骨外科)

脊髓損傷(SCI)是指因各種原因導致脊髓受損，在損傷部位及其以下節段出現運動、感覺功能障礙等一系列病理變化，是一種致殘率高、后果嚴重的中樞神經系統損傷〔1〕。治療重點在于最大程度減少繼發性損傷，挽救已經受損的脊髓神經元，同時積極評價損傷程度，促進損傷后的神經修復和再生，以達到受損脊髓的結構、功能重建〔2〕。現有研究對于SCI的治療主要集中于早期的手術干預、藥物治療及疾病后期的功能鍛煉等方面，但均療效不穩定，且術后并發癥較多，患者常處于截癱狀態〔3〕。因此，促進SCI后功能恢復是目前研究的熱點。Toll樣受體(TLR)4是TLR超家族受體中最早被發現的受體之一，研究發現其在SCI后表達明顯增高，與SCI后早期存在一系列針對受損脊髓細胞的炎癥級聯反應密切相關〔4〕。有效調控SCI后TLR4動態表達可為SCI治療提供思路。骨髓間充質干細胞(BMSCs)具有強大增殖和多向分化的潛能，是位于骨髓腔內的一類非造血干細胞〔5,6〕。本研究擬觀察SCI大鼠BMSCs移植后TLR4的表達，進一步探討BMSCs抑制炎癥反應的機制。

1 材料與方法

1.1動物 4周齡雄性Wistar大鼠6只，清潔級，體重110～130 g，平均(120.47±4.31)g，提取BMSCs；8周齡雄性Wistar大鼠100只，清潔級，體重110～130 g，平均(112.35±5.10)g，建立SCI模型。大鼠均由山東大學實驗動物中心提供，使用許可證：SCXK(魯)20130009。實驗大鼠飼養于同一環境中，溫度26～28℃，濕度40%～60%，光周期調節為12 h/24 h，實驗前所有大鼠適應性飼養7 d后進行實驗。

1.2試劑和藥物 0.25%胰酶(HyClone)，培養基DMEM/F-12(Life Technologies Corporation)，青、鏈霉素(美國Solarbio)，氨芐青霉素鈉、胎牛血清(FBS，浙江四季青生物工程材料有限公司)；兔抗大鼠單抗TLR4(BOSTER)；辣根酶標記山羊抗兔免疫球蛋白(Ig)G(H+L)(ZSGB-BIO)；濃縮型二氨基聯苯胺(DAB)試劑盒(ZSGB-BIO)；小鼠抗大鼠單克隆抗體CD90.1(Thy-1.1)-PE(eBioscience)；小鼠抗大鼠單克隆抗體CD45-FITC(eBioscience)；小鼠抗大鼠單克隆抗體CD29(Integrin beta 1)-FITC(eBioscience)；cDNA第一鏈合成試劑盒(Thermo Fisher)；TRIzol試劑盒(eBioscience)；瓊脂糖(Biowest)；實時熒光定量PCR主混合液(TOYOBO)。

1.3儀器 164-5051-PowerPacTM基礎電泳儀(美國Bio-Rad)，BL21S-分析天平(德國Sartorius)，T02323-二氧化碳培養箱(美國Sheldon Plumbing Inc.)，PM-10AD-倒置相差顯微鏡(日本Olympus)，XW-80A-渦旋振蕩器(其林貝爾儀器制造有限公司)，ST16R-高速冷凍離心機(美國Thermo Sorvall)，UV-2450-紫外光度儀(日本SHIMADZU)，2 ml-組織勻漿器(海門市愛苯德實驗器材有限公司)， HY-4-脫色搖床(江蘇金壇市正基儀器有限公司)，HS-840U-超凈工作臺(蘇州凈化設備有限公司)，YY0088-92-微量進樣器(江蘇欣悅玻璃儀器有限公司)，G:BOX Chemi XR5-凝膠成像分析系統(Syngene,UN)，MDF-U7386S-sanyo超低溫冰箱(日本三洋公司)，FACSCalibur-流式細胞儀(美國Becton Dicknson)，H7650-透射式電子顯微鏡(日本日立公司)，200目細胞過濾篩(北京索萊寶科技有限公司)。

1.4方法

1.4.1SCI大鼠模型制備 模型大鼠制備參照Song等〔7〕的垂直打擊方法：腹腔注射10%水合氯醛麻醉，大鼠固定，取俯臥位。對手術視野區皮膚常規消毒。以T10位置為中心，縱向切開大鼠背部皮膚，鈍性分離皮下組織，切口約4.0 cm，分離錐旁肌肉，暴露T9～T11椎骨；用錐板鉗去除T9～T11棘突及錐板，充分暴露T10段骨髓。提前固定艾倫試驗打擊裝置，從約10 cm高度的位置讓5 g的固體打擊物垂直下落并對T10段脊髓部位準確打擊。用含有青、鏈霉素的生理鹽水對傷口進行沖洗，隨后逐層縫合組織。造模完成后，對所造模型進行評價。評價標準：在用艾倫試驗裝置垂直撞擊大鼠脊髓時，大鼠尾巴發生翹起并迅速倒下，身體抖動，雙下肢迅速回縮，打擊部位非常迅速的出現淤血征象。不符合評價標準，或因尿、便潴留，感染等原因死亡的大鼠均未納入此次研究。

1.4.2BMSCs的培養、鑒定及移植

1.4.2.1BMSCs懸液收集 斷頸處死重約120 g的雄性Wistar大鼠，將其于75%酒精中全身浸泡15 min消毒。無菌條件下迅速取出股骨和脛骨，剪斷兩端骨垢端使骨髓腔充分暴露，空針吸取含10 ml左右的DMEM/F-12培養基沖洗骨髓腔，收集沖洗液并吹打后過濾，配平離心管，1 200 r/min離心5 min，棄上清液；5 ml加入培養基吹打混勻并重懸、收集細胞。

1.4.2.2培養、擴增 以1×108/L的濃度將收集到的BMSCs接種于無菌細胞培養瓶中，于5%CO2、37℃的細胞培養箱中進行培養，每3～4 d進行1次全部換液，每日利用倒置顯微鏡對BMSCs細胞形態變化及生長情況進行觀察，生長達80%～90%時進行傳代：瓶內培養基棄去后加入2 ml胰酶消化液進行消化，采用倒置顯微鏡進行觀察，當貼壁細胞形態大部分變圓，細胞間間隙變大并開始脫落時，將含有FBS的培養基加入使消化終止；1 200 r/min收集細胞懸液并離心，棄去上清液，加入含FBS的培養基進行重懸，按1∶3比例進行傳代培養。

1.4.2.3鑒定 用0.25%胰酶消化并收集已貼壁的P3、P4代細胞，1 000 r/min×5 min，4℃離心，用含1%牛血清白蛋白(BSA)的磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗3次，進行細胞計數，設A、B、C共3組樣品，每組樣品最小細胞濃度調節為106/100 μl，3組樣品分別加入小鼠抗大鼠單克隆抗體CD29-FITC、小鼠抗大鼠單克隆抗體CD90-PE、兔抗大鼠單克隆抗體CD45-FITC各10 μl，同時設立每管樣品的同型陰性對照。冰盤上避光孵育30 min，用含1%BSA的PBS洗滌細胞3次，1 000 r/min離心5 min，用含1%BSA的PBS重懸細胞，上流式細胞儀進行檢測分析。

1.4.2.4重懸、計數 收集P3代細胞，PBS緩慢洗滌細胞；加入胰酶消化液5 ml消化，采用倒置顯微鏡進行觀察，當貼壁細胞形態大部分變圓，細胞間間隙變大并開始脫落時，將含有FBS的培養基加入使消化終止；離心及PBS漂洗3次，對收集到的BMSCs細胞重懸并計數，使每0.2 ml PBS含BMSCs細胞2×106個備用。

1.4.2.5移植 隨機將大鼠分為假手術組、模型組、BMSCs移植組(簡稱移植組)；后2組又各分為1 d，3 d，7 d 3個不同的時間點，每組15只，假手術組10只。SCI模型建立后，對移植組大鼠立即用微量移液管經尾靜脈緩慢注入BMSCs單細胞懸液200 μl。操作中須保證注射時間至少3 min以上，注射完畢后留針5 min以上。假手術組和模型組大鼠經尾靜脈給予等體積的生理鹽水。大鼠術前12 h開始禁食，不禁水。

1.5取材 各組根據時間點分別于尾靜脈用藥后1 d、3 d、7 d取材，假手術組于術后7 d取材；采用10%水合氯醛麻醉大鼠，并用4%的多聚甲醛溶液進行組織灌注固定，沿背部原切口進入，鈍性分離皮下組織及肌肉，迅速切斷神經根，游離脊髓，切取損傷中心1 cm脊髓組織備用。

1.6指標檢測 ①脊髓功能評分。采用脊髓損傷運動功能(BBB)評分法〔8〕于移植后1 d，3 d，7 d對大鼠SCI前后的行為及后肢運動功能進行評定。在評分前所有動物檢查膀胱充盈度，以減少實驗誤差。②免疫組織化學染色法檢測TLR4表達，石蠟切片常溫放置30 min；依次放入二甲苯和酒精梯度脫蠟；0.01 mol/L的PBS洗滌3次，每次5 min；置入含胰酶濃度5 mg/ml、氯化鈣(CaCl2)濃度10 mg/ml的胰酶修復液中，置于37℃恒溫箱中酶修復20 min；PBS沖洗3次，每次5 min；放入3%過氧化氫(H2O2)內10 min；PBS沖洗3次，每次5 min；置入0.03%聚乙二醇辛基苯基醚中孵育10 min；PBS沖洗3次，每次5 min；山羊血清封閉1 h；加入兔抗大鼠單抗TLR4(濃度1∶100)后于4℃條件下過夜，陰性對照組加PBS；PBS沖洗3次，每次5 min；加入二抗，孵育1 h，DAB顯色，常規脫水并封片。記錄平均光密度值(MOD)。③實時熒光定量PCR檢測。利用TRIzol試劑盒提取總RNA，測定RNA含量并進行反轉錄。取反轉錄產物，進行RT-PCR反應。采用20 μl反應體系，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)為內參，引物序列如下：正義鏈：5′-CTCACACCTTCAGTGGCTGGATTTA-3′，反義鏈5′-GTCTCCACATCCACCAGATTATC-3′；。總反應體系包括主混合液10 μl，cDNA 1 μl，0.1%焦碳酸二乙酯水7 μl，上下游引物各1 μl。目的基因表達量采用2-ΔΔCT法進行分析。

1.7統計學方法 采用SPSS18.0軟件進行單因素方差分析、t檢驗。

2 結 果

2.1BMSCs的鑒定 流式細胞儀檢測結果表明，培養的BMSCs表面抗原中，CD29和CD90呈陽性表達，CD45呈陰性表達，P3代BMSCs CD29、CD90表達率分別為87.38%、71.26%，CD45表達率為0.56%；P4代BMSCs CD29、CD90表達率分別為88.20%、80.44%，CD45表達率為1.35%。表明分離獲得的細胞符合BMSCs的特征，結合培養的細胞對塑料底物的貼附特性及形態觀察，說明分離得到所需的BMSCs。

2.2脊髓功能評分 模型組大鼠BBB評分較假手術組顯著降低(P<0.05)。與模型組比較，移植組術后3 d、7 d BBB評分明顯升高(P<0.05)。同組間比較，模型組和移植組術后BBB評分均隨時間逐漸升高(P<0.05)。見表1。

2.3TLR4蛋白及mRNA表達 模型組TLR4蛋白及mRNA水平較假手術組明顯增高(P<0.05)。與模型組比較，移植組1 d TLR4蛋白及mRNA水平差異無統計學意義(P>0.05)，移植組3 d、7 d TLR4蛋白及mRNA水平均顯著降低(P<0.05)。同組間比較，模型、移植組TLR4蛋白及mRNA表達均呈先增后減趨勢，以損傷后3 d達高峰，7 d時顯著降低，以移植組降低明顯(P<0.05)。見表1。

表1 各組移植后不同時間點BBB評分、TLR4蛋白及mRNA表達比較

與假手術組比較：1)P<0.05；與模型組比較：2)P<0.05；與同組別1 d組比較：3)P<0.05；與同組別3 d組比較：4)P<0.05

3 討 論

脊髓是中樞神經系統的重要組成部分，主要由神經元和起營養支持作用的神經膠質細胞構成。SCI包括原發性和繼發性損傷兩種。原發性損傷是瞬時且不可逆的，是指由于撞擊力或機械力直接造成組織撕裂或變形〔9〕；繼發性損傷常發生在SCI后幾小時至數天內，其損傷造成的后果中，既有損害激活的脊髓自身的慢性反應性損傷，又有損傷周圍組織的炎癥性損傷〔10〕。研究顯示，引起脊髓繼發性損傷的具體機制有細胞凋亡、炎性反應、電解質失衡、創傷后缺血、線粒體功能紊亂、興奮性中毒、自由基損傷和再灌注損傷等，且繼發性損傷對脊髓的損傷程度遠遠超過原發性損傷〔11，12〕。炎癥反應在引起SCI的繼發性損傷中發揮重要作用，多種炎癥因子的浸潤，導致大量神經膠質細胞和神經細胞功能受損，并逐漸壞死和凋亡，而壞死、凋亡的細胞會釋放更多的炎癥因子，形成惡性循環，使損傷范圍不斷擴大。小膠質細胞活化產生的神經毒性在SCI后炎癥反應中發揮重要作用。研究表明，小膠質細胞的活化被認為是脊髓微環境改變最敏感的指標之一〔13〕。SCI時，活化的小膠質細胞一方面釋放相關神經營養因子以保護損傷的脊髓組織，另一方面又能釋放多種炎性因子通過相關信號轉導通路啟動炎癥反應，從而加重SCI〔14〕。而在這些炎癥因子中，Toll樣受體超家族中的TLR4的表達最為豐富。

TLR4被配體激活后可產生促炎因子和炎癥趨化因子，從而調節天然免疫，防止微生物入侵〔15〕。研究表明〔16〕，TLR4在炎癥反應過程中發揮重要作用，可以作為起始因子啟動相關炎性過程。研究證實〔17〕TLR4在SCI后炎性病理進程中有重要作用。因此，探索有效降低SCI后TLR4的表達或許能為損傷后神經功能修復提供新的思路。

BMSCs是一類具有多向分化潛能和高度自我更新能力的非造血干細胞，不僅能分化成骨細胞、脂肪細胞，也能分化成神經細胞，促進神經系統損傷后的功能恢復。BMSCs來源豐富，提取方便，易于分離純化和體外擴增，且可免于倫理學爭議和移植后的免疫排斥問題，這就為SCI的干細胞移植治療提供理想的“種子細胞”〔18〕。研究顯示〔19〕，體外培養的BMSCs可通過直接注射移植、經蛛網膜下腔注射移植、經靜脈注射移植等多個途徑移植到SCI部位，通過向特定損傷部位的遷徙和歸巢，一方面向特定組織分化，以彌補壞死和凋亡的神經細胞，另一方面可分泌多種神經營養因子，給壞死區域神經細胞提供“能量”，促使損傷后神經修復和重建，此外其還能減輕損傷后的炎癥反應，抑制氧化應激，發揮促進SCI恢復的作用。王晶等〔20〕研究顯示，將培養好的BMSCs經肋間動脈移植到SCI模型家兔體內，能明顯促進損傷后的神經軸突的再生，且有效抑制膠質瘢痕的形成，顯著促進脊髓功能恢復。有學者〔21〕提出，BMSCs促進SCI損傷后神經功能恢復可能與下調纖維酸性蛋白和CSPG表達有關，促進損傷后神經軸突的再生。

本研究結果顯示，SCI后大鼠行為學BBB評分顯著降低，隨著損傷時間的延長，大鼠BBB評分輕度恢復，提示SCI后機體自身可代償性的發揮抗損傷作用，其機制可能與自身的生理情況下處于休眠狀態的神經干細胞向損傷的脊髓細胞分化以減輕損傷有關。但是，由于機體自身神經干細胞的數量有限，且損傷后局部微環境改變影響神經干細胞的正常分化，因此，這種修復能力非常有限。而通過BMSCs移植后，移植組SCI模型大鼠行為學BBB評分顯著提高，提示BMSCs可顯著促進SCI損傷后的功能恢復。在對TLR4表達的影響方面，SCI后TLR4表達顯著增高，提示SCI后炎性反應被激活，各種炎癥介質浸潤，而其中TLR4發揮重要作用。隨著損傷延長，TLR4表達呈先增后減趨勢。而BMSCs移植后，TLR4表達顯著降低，提示BMSCs移植能明顯抑制SCI后TLR4表達，從而減輕炎癥反應。

綜上所述，應用BMSCs移植可顯著促進SCI后的神經功能恢復，抑制損傷后的炎癥反應，其機制可能與動態干預損傷后TLR4的表達有關。