脊髓背角NMDA受體NR2B亞基對舒芬太尼耐受形成的作用

陳英 洪道先 宋俊杰 范軍朝 龐紅莉 鄭孝振

(河南大學(xué)第一附屬醫(yī)院麻醉科，河南 開封 475000)

舒芬太尼是新型的阿片類鎮(zhèn)痛藥，廣泛應(yīng)用于外科手術(shù)鎮(zhèn)痛、腫瘤止痛等〔1〕。但在臨床應(yīng)用中會出現(xiàn)耐受性，嚴(yán)重影響其鎮(zhèn)痛作用〔2〕。有研究表明，N-甲基-D-天門冬氨酸(NMDA)受體拮抗劑可增強(qiáng)阿片類藥物的鎮(zhèn)痛作用，并預(yù)防阿片耐受的產(chǎn)生〔3〕。NR2B是NMDA受體的一個亞基，研究表明NR2B亞基對NMDA受體通道的許多生物物理和藥理學(xué)特性起決定作用，廣泛參與學(xué)習(xí)記憶、痛覺感知和中樞敏化的形成〔4〕。據(jù)此推測NR2B亞基可能參與舒芬太尼耐受的形成。本研究通過復(fù)制舒芬太尼耐受動物模型，分析舒芬太尼大鼠模型脊髓背角中NR2B亞基的表達(dá)情況，從分子生物學(xué)角度研究脊髓背角NMDA受體NR2B亞基對舒芬太尼耐受形成的作用。

1 材料與方法

1.1實驗動物 選擇健康雄性SD大鼠40只，體重220～250 g，動物購自河南大學(xué)醫(yī)學(xué)實驗動物中心，合格證編號為SCXK(豫)：2015-001，動物購買后先適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w。

1.2主要試劑及儀器 舒芬太尼(德國 Impfstoffwerk Dessau-Tornau GmbH 公司，批號160325)，NR2B兔抗鼠多克隆抗體(美國 Chemicon 公司批號0160221)，β-actin兔抗鼠多克隆抗體(美國 Chemicon 公司01603219)，TRIzol(美國Invitrogen 公司，批號015234)，RT-PCR 試劑盒(美國 MBI 公司，批號015725)，蛋白提取試劑盒(上海貝博生物科技有限公司，批號20151203)。

電子機(jī)械性痛敏儀(美國 IITC 公司)，熱痛測試儀(成都泰盟生物科技有限公司)，倒置顯微鏡(日本奧林巴斯，型號CX23)，電泳儀(北京六一儀器廠，型號DYCZ30D)，凝膠成像系統(tǒng)(上海培清科技有限公司，型號JS-786)，Image-pro-plus6.0 圖像分析軟件。

1.3舒芬太尼模型復(fù)制及分組 隨機(jī)選取20只大鼠為舒芬太尼組每天于8∶00和20∶00皮下注射舒芬太尼，劑量80 μg/kg，連續(xù)注射9 d。其余20只為空白對照組，每天于8∶00和20∶00皮下注射生理鹽水。

1.4機(jī)械性刺激痛閾測定 取空白對照組和舒芬太尼組分別于皮下注射前和注射第3、9天測量每只大鼠左后掌面的機(jī)械性刺激痛閾。將待測大鼠固定于電子機(jī)械性痛敏儀透明玻璃盒罩的金屬框架上，適應(yīng)環(huán)境15 min，使用Von Frey纖維向上刺激大鼠后爪的跖表面(內(nèi)側(cè)面和外側(cè)面)，由輕至重增強(qiáng)上行力量直致大鼠后爪出現(xiàn)敏銳的回縮，記錄電子顯示屏上的機(jī)械性刺激痛閾，每只連續(xù)測量3次，測量間隔時間10 min，取其3次平均值作為每只機(jī)械性刺激痛閾值〔5〕。

1.5熱縮足潛伏期測定 舒芬太尼組和空白對照組分別于皮下注射前和注射第3、9天測量每只熱縮足反射潛伏期。測量時將熱痛測試儀的刺激強(qiáng)度設(shè)置為100檔，刺激的最長時間設(shè)置為20 s，每只連續(xù)測量3次，測量間隔時間5 min，取其3次平均值作為每只熱縮足潛伏期值〔6〕。

1.6脊髓背角NR2B亞基蛋白表達(dá)水平 空白對照組和舒芬太尼組分別于皮下注射第3、9天，機(jī)械性刺激痛閾和熱縮足潛伏期測定之后各取10只大鼠，斷頭處死，取左側(cè)的L4～L5脊髓背角組織，勻漿，提取脊髓背角組織總蛋白，取40 μg的蛋白加入到上樣緩沖液中水煮變性，將變性后的蛋白樣品加入到十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)中電泳(濃縮膠100 V、分離膠120 V)，轉(zhuǎn)膜(200 mA，80 min)至醋酸纖維素膜上，封閉2 h，NR2B兔抗鼠多克隆抗體和β-actin兔抗鼠多克隆抗體，4℃孵育過夜，二抗常溫孵育60 min，涂電化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑，暗室中曝光膠片，暗室中膠片浸泡于顯影液和定影液。對條帶的吸光度進(jìn)行掃描，通過吸光度值對比各目的蛋白的相對含量。

1.7脊髓背角NR2B mRNA表達(dá)水平 空白對照組和舒芬太尼組分別于皮下注射第3、9天，機(jī)械性刺激痛閾和熱縮足潛伏期測定之后各取10只大鼠，斷頭處死，取左側(cè)的L4～L5脊髓背角組織，提取脊髓背角組織中的總RNA，將提取的總RNA逆轉(zhuǎn)錄成互補(bǔ)的cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增。95℃變性5 min，94℃變性30 s，56～60℃梯度退火30 s，72℃延伸40 s，連續(xù)反應(yīng)35個循環(huán)。將反應(yīng)所得的產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠中電泳分離，掃描分離凝膠條帶的吸光度，通過對比吸光度值對比各目的mRNA的相對含量。在擴(kuò)增過程中NR2B mRNA上游引物：5′-TGCACAATTACTCCTCGACG-3′，下游引物：5′-TCCGATTCTTCTTCTGAGCC-3′，片段長度222 bp；β-actin上游引物：5′-ACTGCCGCATCCTCTTCCTC-3′，下游引物：5′-ACTCCTGCTTGCTGATCCACAT-3′，片段長度480 bp。

1.8統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS11.5統(tǒng)計軟件進(jìn)行方差分析。

2 結(jié) 果

2.1兩組舒芬太尼耐受過程中機(jī)械性刺激痛閾、熱縮足潛伏期比較 兩組注射前機(jī)械性刺激痛閾值、熱縮足潛伏期差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；舒芬太尼組注射后第3、9天均顯著大于注射前，且注射后第3天顯著大于注射后第9天，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)，見表1。

表1 兩組機(jī)械性刺激痛閾、熱縮足潛伏期比較

與注射前比較：1)P<0.05；注射后第3天比較：2)P<0.05；下表同

2.2舒芬太尼耐受過程中脊髓背角NR2B亞基蛋白及mRNA表達(dá) 舒芬太尼組注射后第3、9天NR2B亞基蛋白、mRNA表達(dá)顯著大于空白對照組，且注射后第3天均顯著小于注射后第9天(P<0.05)，見表2、圖1。

表2 舒芬太尼耐受過程中脊髓背角NR2B亞基蛋白及mRNA表達(dá)比較

圖1 舒芬太尼耐受過程中脊髓背角NR2B亞基蛋白及mRNA表達(dá)

3 討 論

舒芬太尼是一種新型的阿片類鎮(zhèn)痛藥，是目前臨床中治療多種急慢性疼痛的常用藥，但長時間使用后會和其他阿片類藥物相似產(chǎn)生耐受性，將嚴(yán)重降低其鎮(zhèn)痛作用〔7，8〕。雖然近年來對阿片類藥物耐受性形成的機(jī)制、防治等做了很多研究工作〔9，10〕，但關(guān)于舒芬太尼耐受形成的報道較少。NADM受體是一種配體門控離子型谷氨酸受體，由多個亞單位組成，其中NR2B亞基是NADM受體十分重要的一個調(diào)節(jié)亞單位。研究表明，NR2B亞基參與脊髓神經(jīng)元的興奮性突觸傳遞及中樞敏化等過程〔11，12〕。Tan等〔13〕應(yīng)用鞘內(nèi)注射NR2B-iRNA抑制脊髓背角NR2B的mRNA表達(dá)，結(jié)果減輕了外周炎癥引起的疼痛反應(yīng)，表明NR2B在脊髓水平傷害性信息傳遞及痛覺過敏的產(chǎn)生和維持中發(fā)揮重要作用。Ko等〔14〕發(fā)現(xiàn)前腦扣帶回皮質(zhì)(ACC)NR2B亞基在阿片類藥芬太尼、嗎啡耐受形成及其引起的突觸可塑性改變中可能起重要作用。Liaw等〔15〕研究發(fā)現(xiàn)突觸后PSD-93蛋白缺乏可減輕阿片類藥芬太尼、嗎啡耐受和精神依賴，且NR2B表達(dá)降低。可見中樞神經(jīng)系統(tǒng)及脊髓水平NR2B亞基在痛覺感知、信號傳遞和阿片類藥耐受過程中起重要作用。

本研究結(jié)果說明舒芬太尼對大鼠產(chǎn)生了鎮(zhèn)痛作用，且隨著連續(xù)皮下注射舒芬太尼次數(shù)的增加，大鼠對舒芬太尼產(chǎn)生了耐受。另外，本文結(jié)果說明舒芬太尼誘導(dǎo)大鼠耐受性形成的機(jī)制可能是通過促進(jìn)脊髓背角NMDA受體NR2B亞基的表達(dá)量增加，為臨床治療和新型高選擇性NR2B拮抗藥物的開發(fā)提供思路。