miR-124靶向調控STAT3調節動脈粥樣硬化中血管內皮細胞的生物學特性

謝民 李社芳 邢海燕 謝翀

(河南中醫藥大學 1中醫基礎理論教研室，河南 鄭州 450004；2第一附屬醫院腦病中心；3第一附屬醫院腎病科；4河南省實驗中學)

內皮細胞損傷和凋亡在動脈粥樣硬化(AS)發生發展中起著重要的作用〔1〕。然而，內皮細胞(ECs)凋亡的分子機制尚不清楚。載脂蛋白(Apo)E是AS的有效抑制劑，高膽固醇飲食可導致ApoE表達缺失的小鼠慢性炎癥反應增強〔2,3〕。微小RNA(miRNA)是小的非編碼RNA，通過與靶基因mRNA的3′非翻譯區(UTR)互補配對進而轉錄后調控蛋白表達〔4〕。大量研究發現，miRNA通過調節多種靶標或信號途徑在AS發生發展中起重要作用〔5～7〕。最近研究發現，在同型半胱氨酸(Hcy)致AS中miRNA-124(miR-124)表達下調，其中機制可能與miR-124啟動子區高甲基化改變有關〔8〕。然而，miR-124在AS中的作用機制仍未闡明。本研究擬探討miR-124 在AS中的作用及潛在分子機制，為防治AS提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1實驗材料 體重28～32 g，6周齡，C57BL/6J背景的雄性ApoE-/-小鼠，購自中國北京華阜康生物科技股份有限公司。miRNA mimic陰性對照(miR-NC)、miR-124 mimic購自中國上海吉瑪；4%多聚甲醛、最佳切割溫度復合物(OCT)包埋劑、蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒、油紅O染色試劑盒、放射免疫沉淀法(RIPA)裂解液、二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒購自上海碧云天公司；人主動脈內皮細胞(HAECs)購于美國ATCC公司；胎牛血清、青霉素/鏈霉素、Lipofectamine 2000、Trizol試劑購自美國Invitrogen公司；含生長因子的內皮細胞培養基(ECM)購自美國Sciencell公司；miRNA 提取試劑盒、miRNA cDNA 第一鏈合成試劑盒、miRNA 熒光定量檢測試劑盒及miR-124和U6引物均購自北京天根生化科技有限公司；氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)購自北京索萊寶科技有限公司；PE-cy7-Pecam-1抗體和FITC-Annexin V Apoptosis Detection Kit I均購自美國BD公司；pmirGLO質粒、Dual Luciferase?Reporter Assay System購自Promega公司；Pecam-1、Vimentin、α-SMA、Bax、Bcl-2、STAT3、β-actin抗體均購自美國CST公司；辣根過氧化物酶聯二抗和電化學發光法(ECL)發光液購自德國Merck Millipore公司。

1.2動物模型構建 動物實驗方案均經河南省中醫藥研究院附屬醫院動物倫理委員會批準，并按照實驗動物使用指南進行。小鼠飼養于無特殊病原體的微隔離籠中，溫度24℃、濕度(40±50)%、明暗交替各12 h。將12只小鼠隨機分為正常飲食(ND)組和高脂飲食(HFD)組，HFD組ApoE-/-小鼠給予HFD(10%豬油、10%膽固醇、2%膽酸鹽和78%基礎飼料)12 w，以形成可見的AS模型；以喂食基礎飼料的ND組小鼠為對照。另外，在HFD處理前，ApoE-/-小鼠通過尾靜脈注射過表達miR-124 的mimics或miR-NC。第12周末，處死小鼠并將分離的主動脈和主動脈竇保存在液氮中備用。

1.3AS病變檢測 將取出的小鼠主動脈弓用4%多聚甲醛固定6 h，30%蔗糖冷凍24 h，OCT包埋并切片，厚度約6 μm。通過HE染色和油紅O染色于顯微鏡下觀察AS損傷。

1.4細胞培養和轉染 將HAECs用含5%胎牛血清、1%青霉素/鏈霉素和添加生長因子的ECM于37℃、5%CO2條件下進行培養。將對數生長期細胞消化，取1×105個接種于24孔板中，待細胞貼壁后融合度達50%時，用Lipofectamine 2000試劑將miR-124和miR-NC瞬時轉染至HAECs，6 h后更換新鮮培養基，繼續培養至48 h，收集細胞用于噻唑藍(MTT)、流式細胞術或蛋白質、miRNA檢測。

1.5ox-LDL處理細胞 細胞轉染后1 d，用100 μg/ml的ox-LDL處理HAECs，然后收集細胞進行MTT、流式細胞術或蛋白質、miRNA檢測。

1.6實時定量PCR(qPCR)檢測miR-124表達 提取各組小鼠主動脈總miRNA及1.5中細胞總miRNA，按 miRNA cDNA 第一鏈合成試劑盒說明書，37℃、60 min將miRNA逆轉錄為cDNA，以cDNA為模板，采用qPCR檢測miR-124表達。qPCR反應條件：94℃、5 min；40個循環：94℃、30 s，62℃、30 s，72℃、30 s。利用2-ΔΔCt計算miR-124相對表達量。

1.7MTT檢測細胞增殖 取1.5細胞，接種于96孔板中，每孔接種3 000個/100 μl的細胞懸液，待細胞貼壁后以此為0 h，分別利用MTT檢測0、24、48、72 h各時點細胞吸光度值，計算細胞生長曲線。

1.8流式細胞術檢測 提取各組小鼠主動脈，利用PE-cy7-Pecam-1抗體分離Pecam-1陽性血管內皮細胞，另取1.5中的處理細胞，以1×106個/ml濃度重懸于磷酸鹽緩沖液(PBS)中洗滌2次，按照FITC-Annexin V/PI凋亡檢測試劑盒說明書，使用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

1.9Western印跡檢測 取分離組織或處理后的細胞，加入適量RIPA裂解液提取總蛋白，BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳分離蛋白樣品，并將分離的蛋白轉至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，用相應的一抗稀釋液及辣根過氧化物酶耦聯的二抗分別進行孵育，ECL發光液在曝光儀上對蛋白條帶進行曝光顯影，以β-actin為內參，Image J軟件分析蛋白相對表達量。

1.10雙熒光素酶報告實驗 用Trizol提取細胞總RNA并逆轉錄為cDNA，使用STAT3的3′UTR特異引物進行PCR擴增，并克隆至pmirGLO報告載體中構建pmirGLO-STAT3(WT)載體，利用Takara點突變試劑盒突變pmirGLO-STAT3(WT)上miR-124結合位點構建pmirGLO-STAT3(Mut)載體。利用Lipofectamine 2000將報告載體、miR-NC或miR-124轉染至HAECs中，48 h后使用Dual Luciferase?Reporter Assay System試劑盒檢測各組細胞熒光素酶活性。

1.11統計學方法 采用SPSS19.0軟件進行獨立樣本t檢驗和單因素方差分析。

2 結 果

2.1小鼠AS模型中miR-124低表達 與ND組相比，HFD組HE染色顯示主動脈損傷面積顯著增加〔(7.10±0.60)%，(18.60±1.50)%〕，而且油紅O染色顯示主動脈竇損傷面積也顯著增加〔(7.60±0.70)%，(28.00±2.10)%〕。隨后分離主動脈弓檢測其中內皮標記物Pecam-1和間充質標志物α-SMA、Vimentin表達水平。與ND組相比，HFD主動脈弓中Pecam-1蛋白表達顯著降低(1.00±0.09，0.28±0.02)，而α-SMA和Vimentin表達顯著升高(1.00±0.10，3.00±0.30；1.00±0.09，2.80±0.25)。上述結果表明在ApoE-/-小鼠中HFD成功誘導了AS模型。HFD組miR-124表達較ND組顯著降低(1.00±0.09，0.31±0.03)；HFD+miR-124組與HFD組相比，主動脈弓中miR-124表達顯著增加(0.31±0.03，0.82±0.08)，同時主動脈損傷面積〔(9.60±0.90)%〕、主動脈竇損傷面積〔(15.30±1.20)%〕、主動脈弓中α-SMA和Vimentin表達均顯著降低(3.00±0.30，1.68±0.16；2.80±0.25，1.36±0.12)，而主動脈弓中Pecam-1顯著增加(0.65±0.05)。結果表明在HFD誘導的ApoE-/-小鼠AS模型中miR-124低表達，其過表達能夠改善HFD誘導的AS損傷。見圖1。

2.2HFD小鼠Pecam-1陽性內皮細胞凋亡變化及Western印跡檢測凋亡相關蛋白表達水平 與ND組相比，HFD組Pecam-1陽性血管內皮細胞凋亡顯著增加，且促凋亡蛋白Bax表達顯著上調，抗凋亡蛋白Bcl-2表達顯著下調；HFD+miR-124組較HFD組Bax表達顯著降低，Bcl-2表達顯著增加。見圖2。

2.3miR-124對ox-LDL處理的HAECs增殖凋亡的影響 與對照組相比，ox-LDL組miR-124表達顯著降低，同時細胞增殖能力顯著降低，促凋亡蛋白Bax表達顯著上調，抗凋亡蛋白Bcl-2表達顯著下調；ox-LDL+miR-124組較ox-LDL+miR-NC組miR-124表達顯著增加，細胞增殖能力恢復，細胞凋亡顯著降低，Bax表達顯著下調，Bcl-2表達顯著上調，見表1，圖3，圖4。

圖1 各組Vimentin、α-SMA、Pecam-1表達水平

圖2 Western印跡檢測凋亡相關蛋白表達水平

表1 各組細胞相對吸光度值

與對照組相比:1)P<0.05；與ox-LDL+miR-NC組相比:2)P<0.05

圖3 MTT檢測細胞增殖變化

2.4miR-124靶向調控STAT3表達 為研究miR-124的作用機制，本研究利用TargetScan預測miR-34a的靶基因，結果發現STAT3 mRNA的3′UTR中含有與miR-124互補結合位點(圖5)，與miR-NC組相比，miR-124與pmirGLO-STAT3-WT共轉后熒光素酶活性顯著降低(1.00±0.09，0.25±0.05)，而miR-124與pmirGLO-STAT3-Mut共轉染后熒光素酶活性無明顯變化(1.00±0.09，0.96±0.09)。Western印跡檢測發現，ox-LDL可刺激HAECs中STAT3表達顯著增加(1.00±0.10，2.50±0.20)，而在HAECs中過表達miR-124較miR-NC相比，細胞中STAT3蛋白表達顯著降低(1.00±0.10,0.34±0.03)。上述結果表明，在HAECs細胞中STAT3是miR-124的作用靶標，miR-124可能通過調控STAT3在AS中發揮作用。見圖6，圖7。

圖4 Western印跡檢測Bax、Bcl-2蛋白表達水平

圖5 miR-124與STAT3 mRNA的3′UTR互補結合示意圖

圖6 ox-LDL處理的HAECs中STAT3蛋白表達

圖7 過表達miR-124的HAECs中STAT3蛋白表達

3 討 論

AS是動脈壁的一種慢性炎癥性疾病，在血管穩態期間，內皮素有助于血管舒張，抑制平滑肌細胞生長，并抑制異常炎癥反應；而在病理條件下，ECs凋亡可通過誘導新生內膜形成、炎性細胞浸潤、脂質運輸和斑塊破裂等在AS的發展中發揮重要作用〔9～11〕。大量研究發現，在血管壁結構改變之前存在ECs功能障礙和損傷，并且許多AS危險因素包括一氧化氮生成或活性增加及氧化應激降低等均被證實可誘導內皮功能障礙，ECs功能障礙被認為是AS的早期特征〔12〕。ApoE是AS的有效抑制劑，多年來，ApoE表達缺失的小鼠常被用于構建AS模型〔2，3〕。HFD小鼠主動脈和主動脈竇損傷面積均顯著增加，且ECs開始表達間充質標記物Vimentin、α-SMA，發生上皮間質轉化〔13〕。然后，Western印跡檢測發現，來自HFD小鼠的Pecam-1陽性ECs中促凋亡蛋白Bax表達均顯著增加，抗凋亡蛋白Bcl-2表達被顯著抑制，這與先前研究報道一致〔14〕。

miRNA是高度保守的小非編碼RNA家族，越來越多證據表明，miRNA幾乎參與了所有的生理和病理過程〔15〕。先前研究表明，miRNA在血管完整性、血管平滑肌細胞(VSMC)增殖和膽固醇代謝中具有重要作用，這些機制對AS和其他心血管疾病的發生和發展至關重要〔16～18〕。最近有報道稱，miRNA在AS中可通過調節內皮細胞存活或死亡發揮作用。例如，miR-26a被發現是一種新型抗凋亡miRNA，可直接靶向血管ECs中的TRPC6抑制AS中的ECs凋亡〔10〕。此外，AS中高表達的miR-429可通過靶向結合并抑制Bcl-2 mRNA的翻譯，導致ECs中Bcl-2表達下調、凋亡增加〔17〕。然而，miR-124在AS中的作用機制仍未闡明。本研究發現HFD小鼠主動脈中miR-124顯著降低，這與先前研究結果一致〔8〕，其中機制可能是AS中miR-124啟動子區呈高度甲基化狀態。此外，本研究通過miR-124聯合HFD處理小鼠發現過表達miR-124可緩解小鼠AS損傷。

ox-LDL是一種重要的AS危險因素，對AS的發生和發展起重要作用〔19〕。ox-LDL可誘導ECs黏附分子表達，減少衍生的松弛因子合成，進而誘導AS發生〔20〕。ox-LDL能夠通過降低抗凋亡基因Bcl-2的表達誘導ECs凋亡〔21〕。本研究結果表明ox-LDL可誘導細胞凋亡增加，進而導致細胞活力顯著降低，而過表達miR-124聯合ox-LDL處理細胞后，ox-LDL對HAECs凋亡誘導作用被顯著抑制，進一步證實miR-124可緩解小鼠AS損傷。眾所周知，miRNA通過抑制靶mRNA的表達來發揮功能。本研究利用TargetScan在線網站預測miR-124的潛在靶標，結果表明，STAT3是miR-124的靶標并且miR-124可抑制STAT3的表達。另外，本研究還發現ox-LDL處理的AS細胞模型中STAT3表達增加，提示在AS中低表達的miR-124 可能通過STAT3參與ECs功能損傷。總之，本研究發現了miR-124在調節AS中ECs凋亡的機制，并為AS創新療法的發展提供了新的思路。