雌激素對去卵巢大鼠空間學習記憶能力及海馬一氧化氮合酶表達的影響

蘇曉云 賀繼平 鄭華 李文青

(山西醫科大學汾陽學院 1護理學系護理人文教研室，山西 汾陽 032200；2解剖教研室；3重慶師范大學體育學院；4濟寧市榮復軍人醫院精神科)

雌二醇(E2)主要由卵巢分泌，不僅可以調節性腺及機體的生殖活動，還可增加腦血流量及提高神經突觸的活性，對記憶和認知功能也有很大影響〔1〕。更年期由于卵巢卵泡活動減少導致雌激素分泌減少可引起多種生理和心理疾病〔2〕。已經表明，雌激素缺乏與神經退行性疾病，包括腦卒中和阿爾茨海默病(AD)等發病有關。Loring-Meier等〔3〕認為絕經前女性AD發病率遠低于同齡男性，而絕經期婦女AD發病率比同期男性高1.5～3.0倍。研究認為，雌激素有助于保持記憶和認知能力，減少和延遲神經障礙發病的風險，并且多數學者認為雌激素替代(HRT)療法可以延緩和阻止絕經期婦女認知功能下降。Gibbs等〔4〕通過雌激素剝奪模擬婦女絕經后狀態，結果發現去卵巢(OVX)大鼠給予雌激素替代治療后空間工作記憶錯誤次數及參考記憶錯誤次數均顯著改善，這些結果提示E2可能在女性更年期認知功能下降方面起到很重要的作用。

一氧化氮(NO)作為中樞神經系統細胞內信使可介導神經信號傳遞和突觸可塑性形成，被認為是學習記憶的主要細胞機制之一〔5〕。NO由一氧化氮合酶(nNOS)催化產生，研究發現，雌激素可通過激活NMDA受體，增強nNOS的表達，激活NO信號，增強學習記憶能力〔6〕。在正常生理情況下，nNOS催化產生的NO與大腦許多區域包括海馬功能改變引起的認知功能下降有關。海馬是邊緣系統學習記憶的關鍵部位，可介導多種形式的學習和記憶并與突觸可塑性形成有關，E2在調節海馬功能方面發揮著至關重要的作用。Tuscher等〔7〕認為海馬是雌激素作用的靶點之一，而且在某種程度上與卵巢摘除引起的認知功能下降有關。因此，E2改善OVX導致的認知功能下降可能是通過調節大腦某些區域nNOS的表達實現的。

基于以上假設，本實驗利用雌性OVX大鼠模擬絕經后女性，以海馬為研究重點，探討E2改善OVX大鼠認知功能的可能機制。

1 材料及方法

1.1動物及分組 SD成年雌性大鼠30只，體重220～250 g，標準嚙齒類飼料飼養，每籠3只，自由攝食、飲水，室溫22～24℃，濕度45%～65%，光暗周期為(光照8∶00～20∶00；黑暗20∶00～8∶00)。將30只大鼠隨機分為假手術組(SHAM組)、OVX組、去卵巢雌二醇組(OVX+E2組)，每組10只。OVX+E2組大鼠每天上午(9：00～10：00)連續8 w腹腔注射0.1 ml(1 mg/ml)苯甲酸E2。

1.2卵巢切除實驗操作 根據前期學者的操作〔8〕，大鼠被麻醉后在鼠腰椎處做縱行切口(1 cm)，結扎輸卵管及血管，隨后切除雙側卵巢(SHAM組操作步驟相同，但不切除卵巢，只切除腹腔中一小塊脂肪)。所有大鼠術后肌注青霉素3 d。

1.3八臂迷宮實驗(ERM) 所有大鼠在E2治療8 w后進行ERM。實驗前大鼠先適應迷宮環境，然后進行八臂迷宮訓練(2次/d)。正式實驗時將大鼠置于迷宮中央，然后將通往八臂的鼠門關注，八臂中2、4、6、8號臂放置餌料，然后將鼠門打開并開啟迷宮分析軟件，測試時間10 min。記錄指標包括工作記憶錯誤次數(WME)，參考記憶錯誤次數(RME)，總記憶錯誤次數(TE)；當大鼠將4臂食物吃完或10 min鐘后，實驗結束，記錄所需時間(TT)。

1.4海馬nNOS取材、切片與染色 腹腔注射戊巴比妥鈉(100 mg/kg)深度麻醉大鼠，多聚甲醛(4%，150 ml)常規心臟灌注，開顱取出腦組織，30%蔗糖溶液后固定。然后將腦組織連續冠狀切片，片厚30 μm，將切片入3%甲醇雙氧水溶液室溫孵育30 min以消除內源性過氧化物酶的活性，37℃孵育20 min，隨后滴加nNOS血清第一抗體100 μl(兔抗大鼠，1∶50)，孵育及磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗后加入生物素標記的羊抗兔第二抗體50 μl，孵育2 h后，DAB顯色，酒精脫水，透明，封片。

1.5海馬nNOS圖像分析 參照大鼠腦立體定位圖譜隨機選取海馬相同區域的5個視野，400倍物鏡下由光學顯微鏡拍攝海馬nNOS的表達，利用形態學顯微圖像分析系統測量海馬nNOS陽性細胞數及面積。

1.6統計學分析 采用SPSS19.0軟件行單因素方差分析。

2 結 果

2.1各組大鼠學習記憶能力測試結果比較 與SHAM組比較，OVX組TT顯著延長(P<0.01)，延長幅度為44.57%；WME、RME及TE均顯著增加(P<0.01)。給予E2替代治療8 w能夠明顯逆轉上述現象，與OVX組比較，OVX+E2組TT顯著縮短(P<0.01)，下降幅度為33.25%；WME、RME及TE均顯著減少(P<0.01)。這一結果提示，E2治療可顯著改善OVX大鼠的學習記憶能力。見表1。

表1 各組ERM完成時間及錯誤次數比較

與SHAM組比較：1)P<0.01；與OVX組比較：2)P<0.01

2.2各組大鼠海馬nNOS免疫陽性細胞數量、面積結果比較 光鏡下海馬分布有大量nNOS，神經元染色為棕黃色，突起明顯。

與SHAM組比較，OVX組海馬nNOS陽性細胞數量(P<0.05)及面積(P<0.01)均顯著降低，降低幅度分別為32.67%及48.03%；OVX+E2組海馬nNOS表達無顯著變化(P>0.05)；經過8 w E2治療，OVX+E2組與OVX組比較，海馬nNOS陽性細胞數量及面積均顯著增高(P<0.01)，增加幅度分別為74.26%及96.72%。見圖1，表2。

圖1 海馬nNOS陽性神經元分布(免疫組織化學染色，×400)

表2 各組海馬nNOS免疫陽性細胞數量及面積比較

與SHAM組比較：1)P<0.01，2)P<0.05；與OVX組比較：3)P<0.01

3 討 論

有越來越多的證據顯示，大腦中雌激素水平不僅與生殖相關的神經內分泌活動有關，而且可以調節大腦的功能，如情緒、記憶及認知等〔9〕。流行病學研究表明，絕經后女性雌激素缺失可能會增加以認知功能下降為主要表現的疾病的發生，如AD〔10〕。通過衰老及雌激素剝奪大鼠發現，雌激素缺乏可影響嚙齒動物的學習記憶能力，包括空間參考記憶、空間工作記憶和非空間學習記憶。Wilson等〔11〕研究認為，短期雌激素剝奪對空間學習記憶能力沒有影響，而超過4～5 w的雌激素剝奪可削弱大鼠認知功能〔12〕，因此，本實驗測試雌激素剝奪8 w大鼠的認知功能，表現為OVX大鼠完成八臂迷宮時間顯著延長，錯誤次數顯著增加，與前期學者研究結果一致〔13〕。雌激素可影響認知功能，Frick等〔14〕通過水迷宮實驗證實，27月齡老年小鼠連續注射E2 5 d可顯著改善小鼠的空間學習記憶能力，而Plamondon等〔15〕給予OVX腦缺血大鼠連續注射E2(100 μg/kg)15 d，結果發現腦缺血大鼠學習記憶能力顯著改善；另外，研究證實E2可以預防與年齡相關的認知能力下降，并且可改善OVX大鼠的學習記憶能力〔16〕。本實驗可以證明雌激素替代可改善卵巢摘除對認知功能的影響，然而有些研究認為雌激素替代治療對認知功能損害沒有重大影響，如Chesler等〔17〕認為雌激素或孕激素對OXV大鼠空間學習和記憶能力均沒有顯著影響。因此，雌激素替代治療是否有利于認知功能的改善還需進一步研究。

NO可以調節學習及記憶過程，包括抑制(被動)逃避學習、空間記憶學習及嗅覺學習〔18〕。Majlessi等〔19〕認為海馬NO的合成對大鼠空間記憶的形成或許是一個很關鍵的因素，給予大鼠NOS阻滯劑可以削弱大鼠的空間學習記憶能力〔20〕。大腦NO含量和NOS活性與腦衰老關系密切〔21〕，nNOS/NO在學習獲得階段具有重要作用，因此可以認為衰老大鼠NO產生不足可能參與大鼠認知功能的衰退〔22〕。另一方面，海馬是動物學習和記憶的中心，由nNOS催化產生的NO對海馬依賴的學習和記憶很重要。本實驗發現OVX大鼠海馬nNOS表達顯著減少，說明海馬NO對學習和記憶有明顯的調控作用；而且，OVX大鼠認知功能下降至少部分是由于損害海馬nNOS神經元導致NO生成減少所致，而OVX大鼠長期注射E2改善學習記憶能力可能與海馬nNOS表達增強有關，但是海馬nNOS增強的機制仍不清楚。E2可增加NO的釋放，增加NOS各亞型蛋白的表達及增加各組織NOS的活性〔23〕。而Nobakht等〔24〕認為雌激素受體可以增加海馬nNOS的活性。并且Zhang等〔25〕發現在中樞神經系統由nNOS催化產生的NO可激活NMDA受體，從而引發長時程增強和突觸可塑性，從而增強學習記憶能力。因此，可以推測E2增加OVX大鼠海馬nNOS活性催化產生的NO可能是雌激素神經保護作用的機制之一，具體機制需進一步研究。