皮膚原位再生醫療技術治療大鼠糖尿病足潰瘍創面的效果及作用機制

馮波 王聰 馮志

(江西省中西醫結合醫院血管外科，江西 南昌 330003)

糖尿病足潰瘍是一種體表潰瘍，主要的治療思路是祛腐和生肌，從分子生物學的角度來看，糖尿病足潰瘍創面愈合的過程是組織細胞分化、增殖、迀移、凋亡的過程〔1〕。皮膚原位再生醫療技術(MEBT/MEBO)具有減少創面感染、消炎止痛、抑制瘢痕組織增生的作用，常用于治療燒傷創面，目前臨床上用其治療糖尿病足潰瘍創面也取得了較好的效果，然而其具體的作用機制尚不明確〔2〕。近年來的研究顯示〔3,4〕，轉化生長因子(TGF)-β1/smad信號通路及Wnt/β-catenin信號通路是創面愈合的重要調控途徑，TGF-β1及磷酸化smad3(P-smad3)蛋白是TGF-β1/smad信號通路的關鍵蛋白，β-catenin mRNA對Wnt/β-catenin信號通路起到重要的調控作用。本研究旨在進一步明確MEBT/MEBO治療糖尿病足潰瘍的作用機制，為臨床提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1實驗動物 選取50只雄性SPF級SD大鼠，體重206～251 g，平均(225.7±8.6)g，自由進食飲水，飼養環境溫度保持在(25.0±1.0)℃，環境濕度控制在(50.0±5.0)%，每天給予12 h光照時間，分籠喂養，每籠10只，適應性喂養1 w后用于后續實驗。實驗大鼠由北京維通利華實驗動物有限公司提供，合格證號 SCXK(京)2012-0001。本研究方案符合動物實驗的倫理學要求。

1.2建模及分組方法 建模方法：建模前所有大鼠均禁食12 h，隨機選取其中40只，采用pH4.2的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液將鏈脲佐菌素稀釋成1%的溶液，腹腔注射，劑量為60 mg/kg，注射后7 d測血糖，糖尿病大鼠建模以血糖大于16.7 mmol/L認為成功，將同等劑量的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液腹腔注射到另外10只大鼠。本研究有32只大鼠成功建造為糖尿病大鼠模型，根據隨機數字表法取其中的30只分為模型對照組、MEBT/MEBO組、貝復濟組，每組10只，正常對照組為10只正常大鼠。各組大鼠建造足潰瘍模型步驟：首先在足背部做3 mm×7 mm的長方形標記，然后局部消毒后沿著標記剪去全層皮膚直至筋膜。造模成功后所有大鼠自由進食飲水，并對模型對照組、MEBT/MEBO組、貝復濟組大鼠的血糖進行監測，1次/w，實驗過程中三組大鼠的血糖控制在16.7～20.0 mmol/L。

1.3治療方法 在足潰瘍大鼠模型建造當天進行治療，其中正常對照組、模型對照組做如下處理：在創面上敷兩層生理鹽水浸泡過的紗布后覆蓋無菌敷料，并且膠布固定。MEBT/MEBO組采用濕潤燒傷膏(汕頭市美寶制藥有限公司，國藥準字Z20000004，規格：每支40 g)進行治療，將軟膏涂于創面，涂抹均勻，外敷兩層MEBT/MEBO紗布，覆蓋無菌敷料，膠布固定。貝復濟組在創面上敷兩層用重組牛堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)外用溶液(珠海億勝生物制藥有限公司，國藥準字S19991021，規格：35 000 IU/瓶)浸泡過的紗布，覆蓋無菌敷料，膠布固定。所有大鼠在上藥前均用呋喃西林溶液進行消毒，每隔2 d換一次藥，共2 w。

1.4創面觀察 治療8 d時，采用滌綸投影膜對創面的大小進行描計，并用MIAS2000圖像分析軟件進行分析，創面愈合率=創面愈合面積/初始創面面積×100%。統計每只大鼠創面完全愈合的時間，計算每組大鼠的平均創面愈合時間。

1.5蛋白質印跡法檢測TGF-β1、P-smad3蛋白 在治療8 d時，采用7%水合氯醛0.5 ml/100 g腹腔注射進行麻醉。取潰瘍創面新生肉芽組織，液氮處理，然后置于-80℃保存待測。取適量處理后的新生肉芽組織，研磨后加入裂解液，4℃下勻漿5 min，然后進行1 h的冰浴，4℃、13 000 r/min離心15 min，取上清液作為樣品。蛋白含量測定采用BCA法，取適量樣品，經十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，后轉移于聚偏二氟乙烯膜上，加入5%的脫脂奶粉后搖床封閉2 h，加入一抗(TGF-β1、P-smad3多克隆抗體購于武漢博士德生物工程有限公司)4℃孵育過夜。用Tris鹽酸緩沖液(TBS)清洗聚偏二氟乙烯膜3次，加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG，室溫避光孵育2 h，采用TBST緩沖液充分洗滌，然后使用化學增強發光法(ECL)發光試劑盒顯影，目標蛋白的灰度值采用凝膠成像系統和Image J軟件進行分析，β-actin作為內參。

1.6RT-PCR檢測β-catenin mRNA 治療8 d時，取四組處理后的新生肉芽組織，研磨后加入裂解液，充分混勻，4℃、12 000 r/min離心5 min，取上清液，加200 μl氯仿，充分混勻，靜置5 min。4℃、12 000 r/min離心10 min，取上清液，加入等體積的異丙醇，充分混勻，靜置5 min。4℃、12 000 r/min離心15 min，取上層血清，加入1 ml乙醇,靜置2 min；4℃、8 000 r/min離心5 min，將上清液舍去，加入20 μl無酶水，吹打至RNA充分溶解，提取RNA。逆轉錄成cDNA。引物序列：β-catenin：上游引物：5′-GGAACTATGACCTCGACTACGAC-3′，下游引物：5′-ACCATGTCTCCTACAGTAGCTC-3′；GAPDH：上游引物：5′-CAGTGCCAGCCTCGTCTCAT-3′，下游引物：5′-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3′。PCR反應條件：95℃預變性2 min；然后40個循環：95℃變性10 s、60℃退火30 s；70℃延伸45 s。GAPDH為內參。

1.7統計學方法 應用SPSS19.0軟件，計數資料行χ2檢驗，計量資料行t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。

2 結 果

2.1四組治療8 d的創面愈合率和平均創面愈合時間比較 四組平均創面愈合時間和治療8 d的創面愈合率整體比較差異均有統計學意義(P<0.001)，模型對照組的平均創面愈合時間高于正常對照組、MEBT/MEBO組、貝復濟組，治療8 d的創面愈合率低于正常對照組、MEBT/MEBO組、貝復濟組(P<0.05)，MEBT/MEBO組的平均創面愈合時間低于貝復濟組，但高于正常對照組(P<0.05)，MEBT/MEBO組和貝復濟組的治療8 d的創面愈合率比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 四組治療8 d的創面愈合率和平均創面愈合時間比較

與模型對照組比較：1)P<0.05；與正常對照組比較：2)P<0.05；與貝復濟組比較：3)P<0.05；下表同

2.2四組TGF-β1、P-smad3蛋白表達比較 四組TGF-β1、P-smad3蛋白表達整體比較差異均有統計學意義(P<0.001)，模型對照組的TGF-β1、P-smad3蛋白表達均低于正常對照組、MEBT/MEBO組、貝復濟組(P<0.05)，MEBT/MEBO組的TGF-β1、P-smad3蛋白表達低于正常對照組(P<0.05)，MEBT/MEBO組和貝復濟組的TGF-β1、P-smad3蛋白表達比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 四組TGF-β1、P-smad3蛋白表達比較

2.3四組β-catenin mRNA表達比較 四組β-catenin mRNA表達整體比較差異有統計學意義(P<0.05)，模型對照組的β-catenin mRNA表達(0.34±0.13)低于正常對照組(1.14±0.21)、MEBT/MEBO組(1.08±0.26)、貝復濟組(0.85±0.13，均P<0.05)，MEBT/MEBO組的β-catenin mRNA表達高于貝復濟組(P<0.05)，MEBT/MEBO組與正常對照組的β-catenin mRNA表達差異無統計學意義(P>0.05)。

3 討 論

糖尿病足是導致糖尿病患者截肢、致殘的原因之一，我國有超過15%的糖尿病患者發生過足部潰瘍或壞疽〔5〕。糖尿病足潰瘍屬于慢性難愈型創面，創面愈合過程紊亂，難以及時、有序地對傷口進行修復。糖尿病足潰瘍創面中具有多向分化潛能的表皮干細胞表達及生物活性減弱，降低了修復能力，同時糖尿病患者糖代謝紊亂，體內產生糖基化終末產物(AGEs)，導致血管內皮細胞的增殖受到抑制；此外，糖尿病足患者體內對創面愈合有重要調節作用的神經肽P物質含量較低，進而抑制了骨髓間充質干細胞的移動，導致創面修復受阻〔6，7〕。美寶濕潤燒傷膏是MEBT/MEBO的主要藥物，主要由黃芩、黃連、黃柏等組成，其中黃芩具有抗氧化、抗菌消炎、清除自由基等作用，黃連能抑制多種細菌、病毒、真菌的生長，黃柏的主要活性成分小檗堿、巴馬汀能對人血管內皮細胞起到保護作用，且美寶濕潤燒傷膏可提供修復創面所需的營養及生理濕潤壞境，利于創面修復〔8〕。貝復濟是治療燒傷創面、體表慢性潰瘍、新鮮創面的常用藥，具有較好的臨床效果，其主要成分bFGF能刺激纖維細胞、血管內皮細胞、神經細胞等多種細胞生長，具有廣泛的生物活性〔9〕。

本次研究說明糖尿病足潰瘍創面由于受到糖尿病的影響較難恢復，同時MEBT/MEBO和貝復濟可促進創面恢復，且MEBT/MEBO能更明顯降低創面愈合時間。另外，本研究還顯示，糖尿病足潰瘍大鼠的TGF-β1、P-smad3蛋白表達及β-catenin mRNA表達降低，創面恢復較慢可能與其存在一定關聯，且MEBT/MEBO可增強TGF-β1、P-smad3蛋白表達及β-catenin mRNA表達。TGF-β1是一種化學趨化因子，能參與炎性反應、調節血管內皮細胞和成纖維細胞活性，TGF-β1在創面的新生肉芽組織中呈現低表達，致使血液供應受阻，不利于肉芽組織生長，進而延緩創面恢復〔10，11〕。smads蛋白是公認的修復相關基因，smad3可通過與smad4形成復合物，促進與創面修復相關的靶基因的表達。P-smad3是活化后的smad3，可接收TGF-β1的刺激信號，使其可發揮正常的作用〔12，13〕。趙亞男等〔14，15〕研究結果顯示，Wnt/β-catenin信號通路下調可能是導致糖尿病足潰瘍創面難以愈合的重要途徑之一，而β-catenin是Wnt/β-catenin信號通路的重要調控因子。由此可見，TGF-β1、P-smad3和β-catenin對糖尿病足潰瘍創面的恢復有重要的影響，MEBT/MEBO可能是通過增強TGF-β1、P-smad3蛋白及β-catenin mRNA的表達促進糖尿病足潰瘍創面的恢復。

綜上所述，MEBT/MEBO可促進創面愈合，對糖尿病足潰瘍創面有較好的治療效果，其作用機制可能是MEBT/MEBO可增強TGF-β1、P-smad3蛋白及β-catenin mRNA的表達。