小柴胡湯聯合紫杉醇對CAL27荷瘤鼠腫瘤組織中Survivin和caspase-3表達水平的影響

邢永新

(興安職業技術學院，內蒙古 烏蘭浩特 137400)

口腔鱗癌在口腔癌中約占比例90%以上，其生長迅速、侵襲力和轉移率高，發病機制尚不清楚，治療手段多為手術及輔助治療〔1～3〕。有研究〔4～6〕表明小柴胡湯能提高機體免疫力并對腫瘤有抑制作用，其在S180、Lewis、C6等荷瘤鼠中的抗腫瘤作用已被證實。化療藥物紫杉醇能抑制腫瘤增殖細胞的有絲分裂、誘導細胞凋亡，最終導致腫瘤細胞死亡〔7〕。本實驗探索小柴胡湯聯合紫杉醇用藥對人口腔鱗癌細胞(CA227)荷瘤鼠腫瘤組織中Survivin和caspase-3表達的影響。

1 材料與方法

1.1材料和試劑 小柴胡湯其成分主要為：柴胡(78.125 g)；黃芩3兩(46.875 g)；人參3兩(46.875 g)；清半夏半升(42.000 g)；炙甘草3兩(46.875 g)；生姜3兩(46.875 g)；大棗(30.000 g)。紫杉醇由Sigma公司提供；人口腔鱗癌細胞CAL27購于長春鼎國生物有限公司；引物、Trizol、實時熒光定量PCR試劑盒購于北京鼎國生物有限公司；兔抗Survivin和caspase-3購于北京博奧森生物有限公司；SP9710試劑盒和二氨基聯苯胺(DAB)顯色試劑盒購于福州邁新生物有限公司。

1.2模型制備 培養人口腔鱗癌CAL27細胞，制備1×106/10 μl的CAL27細胞懸液，在雄性9周齡BALB/c裸鼠，體重(25.3±1.6)g，右前肢腋窩皮下接種。

1.3實驗分組、給藥及取材 待腫瘤長至120～150 mm3時，隨機分為4組(n=10)：腫瘤對照組、小柴胡湯組(50 g/kg)、紫杉醇組(30 mg/kg)、聯合用藥組；每組分別灌胃和腹腔注射生理鹽水或相應藥物，劑量均為0.1 ml，連續隔天給藥7次，于最后一次給藥后次日處死動物，摘取腫瘤組織(部分-20℃凍存待測，部分固定于4%多聚甲醛液中)。

1.4指標檢測 (1)CAL27荷瘤鼠腫瘤組織中Survivin、caspase-3 mRNA水平的檢測。Trizol提取腫瘤組織總RNA，每個樣本基因擴增3次，行實時熒光定量PCR檢測Survivin、caspase-3 mRNA水平，取Ct值均值，采用2-ΔΔCt表示目的基因相對表達水平。(2)CAL27荷瘤鼠腫瘤組織中Survivin、caspase-3蛋白陽性表達強度的檢測。常規石蠟包埋，切片3 μm兩張，80℃烤箱烘烤6 h，然后脫蠟至梯度酒精至水洗，采用檸檬酸抗原修復液進行抗原修復，分別滴加Survivin、caspase-3抗體，抗體稀釋液濃度均為1∶800，嚴格按照說明書操作，DAB顯色后，用蘇木精復染，樹膠封片。用OLYMPUS BX51顯微鏡觀察攝取圖片，采用Motic Images Advanced 3.2圖像分析軟件，檢測光密度值(OD值)，OD值越大陽性表達越強。

1.5統計學方法 采用SPSS17.0軟件行t檢驗。

2 結 果

2.1各組CAL27荷瘤鼠腫瘤組織中Survivin、caspase-3 mRNA水平的比較 與腫瘤對照組比較，小柴胡湯、紫杉醇、聯合用藥組CAL27荷瘤鼠腫瘤組織中Survivin mRNA水平均降低，且依次降低趨勢明顯，組間差異有統計學意義(P<0.05)，caspase-3 mRNA水平均升高，且依次升高趨勢明顯，組間差異有統計學意義(P<0.05)，見表1。

2.2各組CAL27荷瘤鼠腫瘤組織中Survivin、caspase-3蛋白陽性表達強度比較 與腫瘤對照組比較，小柴胡湯、紫杉醇、聯合用藥組CAL27荷瘤鼠腫瘤組織中Survivin蛋白陽性表達強度均降低，且依次降低趨勢明顯，組間差異有統計學意義(P<0.05)，caspase-3蛋白陽性表達強度均升高，且依次升高趨勢明顯，組間差異有統計學意義(P<0.05)，見圖1、2，表1。

圖1 CAL27荷瘤鼠腫瘤組織中Survivin蛋白陽性表達(DAB，×200)

圖2 CAL27荷瘤鼠腫瘤組織中caspase-3蛋白陽性表達(DAB，×200)

表1 CAL27荷瘤鼠腫瘤組織中Survivin、caspase-3蛋白陽性表達強度及mRNA水平比較

與腫瘤對照組比較：1)P<0.05；與小柴胡湯組比較：2)P<0.05； 與紫杉醇組比較：3)P<0.05

3 討 論

紫杉醇提取于紫杉屬樹皮，是美國FDA批準的抗癌癥臨床藥物，它能促進微管聚合抑制微管解聚形成穩定的微管聚合物，從而抑制腫瘤增殖細胞的有絲分裂促進細胞凋亡，目前已證實在多種實體瘤的治療中有較高的療效〔7，8〕。 小柴胡湯為中醫經典方劑，它具有疏肝利膽、通達表里陰陽、協調臟腑等多種功用〔9〕。近年研究發現小柴胡湯還能降低化療藥物對機體臟器的損傷，通過促進淋巴細胞轉化提高機體細胞免疫及體液免疫功能〔10，11〕。目前研究發現腫瘤的侵襲、轉移、預后與細胞凋亡、細胞周期調控密切相關。Survivin是凋亡抑制蛋白家族的重要成員之一，其結構獨特能夠調節細胞分裂、細胞凋亡及信號傳導，在腫瘤組織中高表達〔12〕。caspase-3 是一種半胱氨酸蛋白酶，以非激活的酶原形式存在于細胞質中，是細胞凋亡重要的效應分子及核心執行者，是凋亡促進因子〔13〕。Survivin在細胞凋亡過程不但可以抑制caspase-3的活性，而且又可間接抑制caspase-3激活，從而阻斷細胞的凋亡過程，因此Survivin、caspase-3參與腫瘤的發生、發展過程〔14，15〕。