基因修飾的脂肪間充質干細胞的研究進展

張晶瑩，孫曉林，耿立霞△

基因修飾，主要是指利用生物化學方法修改DNA 序列，達到改變宿主細胞基因型或者使得原有基因型得到加強的效果。目前常用于基因修飾的病毒載體有腺病毒、逆轉錄病毒和慢病毒3 種。其中腺病毒載體具有制備簡單、易轉染、表達目的基因效果強、免疫排斥反應低、安全性好等優勢［1］。間充質干細胞（Mesenchymal stem cells，MSCs）是一群具有多向分化潛能并可自我復制的多能干細胞。目前研究比較多的是骨髓間充質干細胞（Bone marrow stem cells，BMSCs），但因取材困難、獲取率低等缺點，其臨床應用受到限制。脂肪間充質干細胞（Adipose tissue-derived stem cells，ADSCs）具有來源充足、取材方便、培養簡單等特點，其臨床應用較BMSCs 更有優勢。ADSCs呈梭形生長，呈平行排列或漩渦狀，具有強大的增殖能力和多向分化潛能，在臨床研究上較BMSCs具有倫理學和安全性優勢［2］。與腫瘤細胞、T 淋巴細胞和 B 淋巴細胞等細胞相同，ADSCs 也具有特異性的細胞表面抗原標志物，研究證實ADSCs 陽性表達 CD73、CD105 和 CD90，陰性表達CD19、CD34 和 CD45［3］。主要組織相容性復合體（Major histocompatibility complex，MHC）參與免疫呈遞、細胞間相互識別及誘導免疫應答等，ADSCs 中MHC表達較低，故其具有低免疫原性［4］，可用于移植治療。ADSCs易被臨床上普遍應用的病毒載體系統所轉染，經骨形態發生蛋白4（Bone morphogenetic protein 4，BMP4）及血管內皮生長因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）等基因修飾后移植到體內，能特異性合成蛋白質，使其對血糖、激素或藥物、化學因素等生理刺激反應更敏感，可有效提高移植后細胞的存活時間、分化能力和聚集濃度，高效穩定地表達目的基因，為一些傳統治療手段無法治愈的疾病帶來曙光。然而目前對ADSCs的研究仍處于基礎研究階段，實驗數據尚不充分。本文對近年來基因修飾的ADSCs在骨組織修復、糖尿病、神經系統、心血管系統等疾病的研究進展進行簡述，并對其臨床研究意義、問題及應用前景進行探討，為其早日投入臨床應用奠定基礎。

1 基因修飾的ADSCs應用于骨組織修復

骨不連、肢體短縮、大段骨缺損等問題一直是骨科疾病治療的常見難點，如何加快骨再生速度、促進術后骨愈合成為臨床上急需解決的難題。Xu等［5］利用在骨生成過程中起重要作用的成骨細胞特異性轉錄因子（Osterix，OSX）轉染ADSCs，結果顯示，與對照組相比，轉染組OSX 過表達且成骨相關基因表達上調，新生骨體積明顯增大，提示OSX修飾的ADSCs對修復骨組織有積極的治療作用。Chen 等［6］將BMP4 轉染至 ADSCs，發現 BMP4 蛋白能夠使 ADSCs定向分化為成骨細胞，轉染后ADSCs 的上清液存在大量BMP4、成骨蛋白（膠原蛋白Ⅰ）及軟骨形成蛋白（膠原蛋白Ⅱ），與ADSCs單純培養組相比，轉染組成骨形成有關的蛋白含量明顯上調，提示BMP4 修飾后的ADSCs 具有加快骨組織修復的作用。Kim 等［7］通過慢病毒載體將VEGF導入ADSCs中，結果顯示，與單純培養的ADSCs 相比，轉染后ADSCs 中VEGF的表達量升高10倍，成骨分化表型基因堿性磷酸酶（Alkaline phosphatase，ALPL）和成骨細胞Ⅰ型膠原（Osteoblast type Ⅰ collagen，COL1）表達明顯上調，提示VEGF 修飾的ADSCs 可以更好地修復骨組織損傷。

2 基因修飾的ADSCs應用于糖尿病的治療

Ⅰ型糖尿病是由于胰島β 細胞被破壞無法再生，導致胰島素絕對缺乏引起糖、脂肪和蛋白質代謝紊亂的一類綜合征。胰島移植是目前治療Ⅰ型糖尿病很好的替代治療手段，具有不良反應少、相對安全的優勢。ADSCs可以誘導胰腺胰島素分泌細胞的再生，并且能夠抑制自身免疫反應，從而提高同種異體胰島移植的存活率，是胰島素分泌細胞來源的理想選擇。胰-十二指腸同源盒1（Pancreatic and duodenal homeobox factor 1，PDX-1）是在胰腺發育中起重要作用的轉錄因子，可以調節胰島素在胰島β細胞中的表達，并可特異性激活基因的轉錄。Bahrebar 等［8］研究發現，將 PDX-1 修飾人 ADSCs 后可以導致胰島樣細胞聚集，并且一些與胰島相關的基因和胰島素呈現高表達。此外，Gao等［9］將PDX-1轉染至ADSCs 15 d后仍可檢測到PDX-1的表達，且胰島素表達水平明顯高于對照組，可有效降低糖尿病大鼠的血糖水平。Liu 等［10］利用肝細胞生長因子（Hepatocyte growth factor，HGF）修飾ADSCs 用于治療勃起功能障礙的糖尿病大鼠，結果顯示，修飾后的ADSCs可使糖尿病大鼠陰莖海綿體內皮和平滑肌含量增加，使勃起功能明顯改善。Zhang 等［11］將神經軸突導向因子1（Neuroaxon guidance factor 1，Netrin-1）導入ADSCs，研究其對糖尿病小鼠慢性缺血后肢的治療效果，發現其可有效調節ADSCs 的增殖、遷移、黏附和抗凋亡能力，促進缺血組織的血管生成，使后肢肌肉的微血管密度升高，加強血運重建，為治療糖尿病周圍神經血管疾病提供新的思路。

3 基因修飾的ADSCs應用于神經系統疾病的治療

神經系統疾病是一種起病緩慢、病程呈進行性發展、預后極差的疾病。目前的治療手段主要以生物學藥物為主，但治療效果并不理想。ADSCs 作為組織工程學理想的種子細胞，為修復神經系統病變的治療帶來新的希望。He 等［12］利用具有調節周圍神經系統修復功能的miR-34a 修飾ADSCs，移植治療坐骨神經損傷大鼠，結果顯示，實驗組坐骨神經功能指數遠高于對照組，能密切反應肌肉神經支配程度的腓腸肌質量顯著增高，髓鞘發達的軸突數目和直徑與正常神經組織相似，為神經再生提供了新的思路。Ghazavi 等［13］將具有神經保護作用的成纖維細胞生長因子1（Fibroblast growth factor 1，FGF1）導入ADSCs后觀察其對短暫實驗性缺血性腦卒中大鼠的影響，發現大鼠梗死區域細胞凋亡指數顯著降低、腦梗死體積減少，提示FGF1 修飾ADSCs 可用于治療缺血性腦卒中。此外，Forouzanfar 等［14］利用FGF1轉染ADSCs 后靜脈注射治療慢性壓迫性損傷大鼠，結果顯示，其可有效減弱慢性壓迫性損傷大鼠機械性及熱超敏反應，減少脊髓結構改變，為治療臨床神經性疼痛奠定基礎。

4 基因修飾的ADSCs應用于心血管疾病的治療

急性心肌梗死是冠狀動脈急性、持續性缺血缺氧所引起的心肌壞死，是全世界死亡率和發病率最高的疾病之一，傳統的藥理學治療并不理想，僅能延緩病情發展。Tbx20作為T-box轉錄因子之一，具有調節心肌細胞生長的作用。Neshati等［15］利用Tbx20轉染ADSCs，可以有效增強心肌分化標志物如輔肌動蛋白α1（Recombinant actinin alpha 1，ACTN 1）、心肌肌鈣蛋白I（Cardiac troponin I，cTnI）、心肌肌動蛋白α1（Cardiac actin α1，ACTC 1）、心臟特異性同源盒（cardiac specific homeobox，Csx）基因（又稱Nkx2.5）等的表達，為再生醫學研究產生心肌樣細胞奠定基礎。Zhang 等［16］利用胰島素基因增強子結合蛋白1（Insulin gene enhancer binding protein 1，ISL-1）轉染ADSCs，并與新生大鼠的心室心肌細胞共培養，模擬體內微環境，發現ISL-1 過表達可顯著增加自發搏動ADSCs 比例，與竇房結表達有關的基因環化核苷酸調控的陽離子通道亞型4（Hyperpolarizationactivated cyclic nucleotide-gated cation channel 4，HCN4）及起搏細胞關鍵標志物縫隙連接蛋白45（Connexin45，Cx45）明顯增加，為生物起搏器生成提供依據。Chen 等［17］構建表達 miR-1 的慢病毒表達載體轉染ADSCs，與心肌細胞共培養，結果顯示，過表達的miR-1 可以促進ADSCs 向心肌細胞分化，心肌細胞特異性標志物心肌肌鈣蛋白I（cardiac troponin I，cTnI）及 轉 錄 因 子 GATA 結 合 蛋 白 4（GATA-binding protein4，GATA4）表達明顯升高，為再生醫學治療心肌梗死提供新的思路。

5 基因修飾的ADSCs應用于其他疾病

Feng等［18］利用miR-21修飾ADSCs，研究發現修飾后ADSCs 可以改善尿道傷口愈合微環境，增強干細胞存活能力，有效調節血管生成基因表達，促進新生血管生成，可有效治療尿道損傷。有研究發現，淋巴管內皮細胞可以移植治療繼發性淋巴水腫［19］。Deng 等［20］利用同源異型盒基因轉錄因子1（Prospero-related homeobox 1，Prox1）轉染人ADSCs，結果顯示，淋巴管內皮細胞特異性標志物表達增加，成功誘導人ADSCs 分化為淋巴管內皮細胞，解決了淋巴管內皮細胞低產的問題。Liu 等［21］研究OX40-Ig 融合蛋白（OX40-immunoglobulin，OX40-Ig）修飾的ADSCs 對大鼠腎移植的作用，結果顯示，修飾的ADSCs 能明顯延長移植腎的平均存活時間，減少同種異體移植排斥反應。

6 結論與展望

綜上所述，基因修飾的ADSCs 可以使目的基因高效表達，延長干細胞的存活時間，分泌對疾病有療效的特定蛋白，在臨床應用上有巨大潛能。盡管基因修飾的ADSCs 在動物實驗研究中表現出顯著療效，但目前尚未經過臨床試驗的驗證。如何在臨床上利用基因修飾的ADSCs 治療疾病，還有許多問題需要深入研究。各種疾病如何選擇對應適宜的基因進行修飾、應用修飾的ADSCs治療疾病的最佳時機、療效最佳的移植劑量、載體系統的安全性等問題均有待研究。總之，基因修飾的ADSCs 為各種疾病的治療提供了新的思路，但相關研究還處于初級階段，很多問題有待深入挖掘。