上海地區草莓灰霉病菌對啶酰菌胺的抗性現狀研究

陳 秀，張頌函，張正煒，黃蘭淇，何翠娟

(上海市農業技術推廣服務中心/上海市農藥檢定所，上海 201103)

灰霉病是一種世界性的重要病害，也是上海地區草莓生產上的一種重要病害，主要由灰葡萄孢(Botrytiscinerea)引起，嚴重影響草莓的品質和產量[1]。目前，化學防治仍是控制該病害的重要手段。灰霉病菌有繁殖快、遺傳變異大和適合度高等特點，連續使用同一藥劑極易產生抗藥性[2～3]。

啶酰菌胺是由德國巴斯夫公司1992年開發、2004年登記的煙酰胺類殺菌劑，2006年在歐美等國家已廣泛應用[4]。作為防治蔬菜瓜果灰霉病效果優良的一種較新的殺菌劑，啶酰菌胺已連續5年作為“上海市農藥重點推薦品種”推薦農戶使用。啶酰菌胺屬于琥珀酸脫氫酶抑制劑類(succinate dehydrogenase inhibitors，SDHIs)殺菌劑，能與呼吸鏈上的蛋白質復合物Ⅱ的輔酶Q位點特異結合，抑制病原菌琥珀酸脫氫酶活性，從而干擾其呼吸作用[4]。SDHIs已廣泛用于防治蔬菜、果樹等作物的灰霉病，但由于其作用位點單一，長期廣泛的使用容易產生田間抗性菌株，國際殺菌劑抗性委員會已將其歸為中度抗性風險殺菌劑[5]。啶酰菌胺是此類殺菌劑中的重要品種，故其抗性風險備受關注。

目前，灰霉病菌對啶酰菌胺的抗性菌株在國外已有多例報道[6]，國內也有檢測出抗性菌株的報道[7]，但上海地區灰霉病菌對啶酰菌胺的抗性現狀尚無系統研究及報道。啶酰菌胺作為上海的重點推薦農藥品種，開展灰霉病菌對其的抗性現狀研究對進行抗性風險評估、指導科學合理用藥和提出抗性管理措施具有十分重要的意義。

1 材料與方法

1.1 菌株的采集與分離 2016年3～5月，在上海地區19個草莓種植點采集了草莓灰霉病樣。病樣采集采用經無菌水浸濕的消毒棉簽輕輕蘸取病果表面灰霉菌霉層后直接放入自封袋中，每個病果只蘸取1次。每種植點采集5個大棚，同一個大棚中采集病果2～3個，每種植點共采集病果10～15個。

用鑷子從棉簽上挑取少量粘附菌體的棉絮，接種在含硫酸鏈霉素的培養基平板上。置于25℃培養4～5d(直到產生孢子為止)，用滅菌的挑針挑取孢子，移到新的培養基平板上，獲得115株純分離物。將115株純分離物編號后保存在凍存管斜面上，置于4℃保存，供試草莓灰霉病菌菌株(表1)。

表1 供試草莓灰霉病菌菌株及其來源

續表

1.2 供試藥劑與培養基 啶酰菌胺原藥(98.0%)由上海悅聯化工有限公司提供。

培養基采用PDA培養基。稱取37g馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(PDA)粉，加入1 000mL蒸餾水，加熱煮沸溶解，121℃高壓滅菌20min，配制PDA培養基。草莓灰霉菌株分離純化制作培養基平板前加入硫酸鏈霉素，調整終濃度為100mg/L。測定草莓灰霉病菌對啶酰菌胺敏感性數據時，將啶酰菌胺母液按一定比例加入配制好的PDA培養基(滅菌后，冷卻至50℃左右加入)，配制成系列濃度的含藥培養基。

1.3 草莓灰霉病菌對啶酰菌胺敏感性的測定 采用菌絲生長速率法[8]，將分離得到的115株灰霉菌株在含藥平板上進行對啶酰菌胺敏感性的測定。將已純化的灰霉菌株接種于PDA平板上，置于25℃培養至近全皿時，用直徑5mm的打孔器在菌落邊緣打取菌塊，表面朝下接種于系列含藥的PDA平板上，以無藥的PDA平板作為對照，每個處理重復3次。將接上菌塊的培養皿置于25℃恒溫培養箱培養5d，用十字交叉法測量菌落直徑，計算菌絲生長抑制率。所得數據用SPSS17.0進行處理，求出毒力回歸方程和EC50值。

灰霉病菌對啶酰菌胺的敏感基線參照張傳清等2007年報道的采用菌落直徑法建立的灰霉病菌對啶酰菌胺的敏感基線1.07±0.11mg/L[9]?？剐灾笖?RF)=測定菌株的EC50/敏感基線的EC50[10]；敏感菌株(S)：RF≤5，低抗菌株(LR)：5100[11]。

1.4 啶酰菌胺對草莓灰霉病田間藥效試驗 2017～2018年，在4個草莓種植點開展了50%啶酰菌胺水分散粒劑防治草莓灰霉病的田間藥效試驗(每年2點)。試驗劑量設為50%啶酰菌胺水分散粒劑防治草莓灰霉病登記的最高制劑用量45g/667m2，間隔7d施藥1次，共施藥3次，考察啶酰菌胺防治草莓灰霉病的實際防效。試驗中以生產上種植戶常用來防治草莓灰霉病的嘧霉胺常用劑量作為對照。具體試驗方法參照農藥田間藥效試驗準則(二)第120部分[12]。

2 結果與分析

2.1 上海地區草莓灰霉菌對啶酰菌胺的敏感性 采用菌絲生長速率法對分離獲得的115株灰霉菌株進行測定，獲得上海地區草莓灰霉病菌對啶酰菌胺的EC50值。各區灰霉菌株的EC50值分布范圍和平均EC50值(表2)。由表2可看出，所有灰霉菌株EC50值在0.028～186.435mg/L之間，不同菌株之間EC50值有較大的差異，表明上海地區草莓灰霉菌株對啶酰菌胺的敏感性已產生了一定程度的分化。

參考張傳清等2007年報道的灰霉病菌對啶酰菌胺的敏感基線1.07±0.11mg/L，可以得出抗性菌株共檢測到16株，其中低抗菌株2株、中抗菌株12株、高抗菌株2株。上海地區草莓灰霉病菌對啶酰菌胺的抗性頻率為13.9%，以中抗為主(10.4%)，低抗和高抗頻率均為1.74%。從各區的抗性菌株檢出情況來看(表3)，閔行、奉賢和崇明未檢測到抗性菌株，青浦抗性菌株檢出率最高、嘉定和浦東次之。測得的2株高抗菌株分別是青浦1株和浦東1株。

表2 上海9個區草莓灰霉病菌對啶酰菌胺的敏感性測定數據

表3 上海地區草莓灰霉病菌抗性菌株數量及比例

2.2 啶酰菌胺防治草莓灰霉病田間藥效試驗數據 本文還研究了50%啶酰菌胺水分散粒劑在最高登記劑量(45g/667m2)防治草莓灰霉病的田間藥效，試驗數據(表4)。從2年的田間試驗數據看，啶酰菌胺對草莓灰霉病的防效優于嘧霉胺，防效尚可，在75.45%～83.72%之間。方差分析表明僅2018年第3次藥后二藥劑在試驗劑量下對草莓灰霉病的防效差異顯著。從年度間進行比較，2017、2018兩年間啶酰菌胺對草莓灰霉病的防效差異并不明顯。就田間實際防效來看，目前在上海地區使用啶酰菌胺防治草莓灰霉病是可行的。

表4 50%啶酰菌胺水分散粒劑防治草莓灰霉病田間藥效試驗數據

3 結論

本文測定了上海地區草莓灰霉病菌對啶酰菌胺的敏感性數據，數據結果表明，上海地區草莓灰霉病菌對啶酰菌胺已經產生了一定的抗性，總抗性頻率為13.9%，抗性菌株多為中抗菌株(10.4%)，但也檢測到2株高抗菌株(1.7%)，抗性狀況需引起一定的重視。啶酰菌胺防治草莓灰霉病三次藥后的田間防效在80%左右，防效尚可滿足生產需要，數據表明目前在上海地區使用啶酰菌胺防治草莓灰霉病仍舊是可行的。

結合兩方面的研究數據，筆者認為，在實際生產中要加強對草莓種植戶的宣教，指導其科學合理用藥，輪換使用防治草莓灰霉病的殺菌劑，可加大使用生物制劑如枯草芽孢桿菌的使用次數，避免長時間使用啶酰菌胺造成灰霉病菌對其抗性的急劇發展，延長防效優良的殺菌劑啶酰菌胺的使用壽命。