化學分析方法驗證和確認的應用研究

(江陰市產品質量監督檢驗所； 國家船舶材料質量監督檢驗中心(江蘇)，江蘇 江陰 214434)

前言

隨著經濟的快速發展和科學技術的進步，新產品、新物質不斷涌現，從而使社會對實驗室檢測能力和水平提出了更高的要求。然而，由于檢測標準無法與快速發展的檢測需求相適應，實驗室往往需要采用非標方法來滿足客戶的要求。另外，隨著實驗室擴大檢測范圍或領域，也需要引進一些新的檢測標準。為了確保實驗室提供的檢測結果準確、可靠，實驗室應在首次采用標準方法之前，對其進行驗證；在首次采用非標準方法前，對其進行確認。如果依據的檢測方法文本中已經給出了驗證或確認程序，實驗室應嚴格執行該方法規定的要求；如果未給出驗證或確認程序，或給出的程序不明確，則需進行驗證或確認。CNAS-CL01：2018《檢測和校準實驗室能力認可準則》[1]和《檢驗檢測機構資質認定評審準則(2015)》[2]均要求實驗室在使用標準方法和非標準方法前要進行驗證和確認，但其并未明確如何進行特性參數的驗證和確認。近幾年發布的國家標準)《化學分析方法驗證確認和內部質量控制要求》(GB/T 32465—2015[3])和《合格評定 化學分析方法確認和驗證指南》(GB/T 27417—2017[4])對化學分析方法驗證和確認提出了指導性指標的要求，然而實驗室在理解和運用這些標準時還存在不少困擾，如不同的分析方法如何獲得檢出限和定量限，準確度等特性參數，如何進行試驗及結果，如何判定等，從而導致實驗室在引進新方法時無從下手，或對方法的驗證/確認工作不到位。針對以上問題，在總結實驗室經驗的基礎上結合相關標準和文獻，對標準方法的驗證和非標準方法的確認方法進行了研究并歸納整理，對廣大化學實驗室具有指導意義。

1 方法驗證/確認特性參數的選擇

在化學分析實驗室引入標準分析方法時，應驗證操作方法是否滿足該標準的要求，即證實該方法(標準方法)能在實驗室現有的設施設備、人員、環境等條件下獲得令人滿意的結果；實驗室引入非標準方法時，應提供客觀證據對特定的預期用途或應用要求是否滿足進行認定。對標準方法特性參數的驗證包含(但不限于)分析系統適應性、空白試驗、準確度、精密度、檢出限和定量限、線性及校準、測量不確定度等；對非標準方法特性參數的確認包含(但不限于)分析系統適用性、選擇性、耐用性、線性及校準、回收率、準確度和精密度、檢出限和定量限、穩定性、測量不確定度等。實驗室可根據現有技術經濟條件決定驗證/確認的內容，但至少應滿足表1的要求。

2 方法特性參數的驗證/確認

2.1 選擇性

一般情況下，分析方法在沒有重大干擾的情況下應具有一定的選擇性。對于化學分析方法，在有干擾的情況下，如：基質成分、代謝物、降解產物、內源性物質等，保證檢測結果的準確性至關重要。實驗室可選用下述兩種方法檢查干擾[3-4]：

表1 典型分析方法驗證/確認參數的選擇

注：—表示參數可不評估；√ 表示該參數必須評估；a 對于痕量化學分析時，需要驗證或評估。

1)分析一定數量(至少3個)的代表性空白樣品，檢查在目標分析物出現的區域是否有干擾(信號、峰等)；

2)在代表性空白樣品、標準溶液或純試劑基質中添加一定濃度的有可能干擾分析物定性和/或定量的物質后，再檢查在目標分析物出現的區域是否有干擾。

2.2 測量范圍

方法的測量范圍應覆蓋方法的最低濃度水平(定量限)和關注濃度水平[5]。

確認方法測量范圍時，至少應確認最低濃度水平(定量限)、關注濃度水平和最高濃度水平的正確度和精密度。

測量范圍確認及判定方式見表2。

表2 測量范圍確認要求及判定方式

2.3 線性范圍

若方法的測量范圍呈線性，除應滿足2.2的要求外，還應滿足下列要求[4]：

1)采用校準曲線法定量，濃度點不得小于6個(含空白濃度，標準中有規定的按標準的規定進行)，濃度范圍一般應覆蓋關注濃度的50%～150%，如需做空白時，則應覆蓋關注濃度水平的0%～150%，每個濃度點至少重復測量2次，根據濃度值與響應值繪制校準曲線。

2)對于準確定量的方法，線性回歸方程的相關系數不低于0.99。

2.4 檢出限和定量限

2.4.1檢出限

通常情況下，只有當目標分析物的含量在接近于“零”的時候才需要確定方法的檢出限或定量限。當分析物濃度遠大于定量限時，沒有必要評估方法的檢出限和定量限。但是對于那些濃度接近于檢出限和定量限的痕量和超痕量檢測，并且報告為“未檢出”時，應確定檢出限和定量限。不同的基質需要分別評估檢出限和定量限。

檢出限的驗證或評估可采用下列方法進行：

1)標準方法已給出檢出限(LOD或MDL)時：

在給出的MDL濃度水平上，通過分析該濃度水平的樣品(n≥10)，以驗證給出的MDL，分析結果應在給出的MDL(±20%)范圍內[3]。

2)方法未給出MDL時，可選用下列一種合適的方法評估檢出限：

A.空白標準偏差法[4]

即通過分析大量的樣品空白來確定檢出限。獨立測試的次數應不少于10次(n≥10)，計算出檢測結果的標準偏差(s)。

檢出限(LOD)=樣品空白平均值+3s

B.國際純粹和應用化學聯合會(IUPAC)規定對各種光學分析方法[6]，可用式(1)計算：

D.L=KSb/s

(1)

式中：

D.L—方法的最低檢出濃度；

Sb—空白多次測量的標準偏差(吸光度)；

s—方法的靈敏度(即校準曲線的斜率)。

為了評估，空白測定次數必須足夠多，最好能測20次以上，取k=3(相應的置信水平大約為90%)。

C.信噪比法[4]

本方法適用于能顯示基線噪音的儀器分析方法。對于定量方法來說，由于儀器分析過程都會有背景噪音，常用的方法就是利用已知低濃度的分析物樣品與空白樣品的測量信號進行比較，確定能夠可靠檢出的最小的濃度。

即S/N≥3

其中：

S—樣品信號值；

N—空白信號值。

D.方法分辨率法

在分光光度法中，以扣除空白值后的與0.01吸光度相對應的濃度值為檢出限。

滴定分析中，以消耗0.02 mL標準溶液所對應的濃度或含量作為檢出限。

2.4.2定量限(報告限)

定量限(LOQ)，又稱報告限[5]，是一個限值，高于該值，定量結果的正確度和精密度可接受。一般實驗室取3～10倍檢出限作為方法的定量限[4]。

注[5]： 檢出限(LOD)。樣品中可被(定性)檢測，但并不需要準確定量的最低含量(或濃度)，是在一定置信水平下，從統計學上與空白樣品區分的最低濃度水平(或含量)。

MDL：方法檢出限。通過分析方法全部檢測過程后(包括樣品預處理)，目標分析物產生的信號能以一定的置信度區別于空白樣品而被檢測出來的最低濃度或含量。

2.4.3檢出限的利用

檢出限是分析測試的重要指標，是分析方法的重要基本參數之一。在日常檢測過程中，檢出限的確定和利用對實驗室報出準確檢測結果和規避風險具有十分重要的意義。實驗室評估出方法檢出限后，可參照以下三種情況利用檢出限：

1)如檢出限等于或略小于標準分析方法所規定的檢出限，則仍采用規定值。

2)如檢出限顯著偏低并被多次測定證實其穩定性很好，也可改用此實測值，但必須在報告中加以說明。

3)如檢出限大于標準分析方法的規定值，則表明空白試驗值不合格，應找出原因并加以改正，直至小于等于規定值后，實驗才能繼續進行。

實驗室檢測結果的表述方式可以分為三種情況(表3)。

2.5 精密度

精密度反映了分析方法或測量系統存在的隨機誤差的大小，測試結果的隨機誤差越小，測試的精密度越高。精密度通常以相對標準偏差的形式表示。

在考察精密度時應注意以下幾個問題：

1)分析結果的精密度與樣品中待測物質的濃度水平有關，因此，必要時應取兩個或兩個以上不同濃度水平的樣品進行分析方法精密度檢查；

2)標準偏差的可靠程度受測量次數的影響，因此，計算標準偏差時需要足夠多的測量次數，一般要求至少重復測定6次，計算時應剔除離群值[7]；

3)標準中對精密度有要求的，應滿足標準的規定；若標準中無精密度要求，其重復測定的標準偏差應滿足表4的要求[4]。

表3 檢測結果的表述方式

表4 實驗室內相對標準偏差

注：1)單位為mg/kg，2)單位為%。

2.6 準確度

準確度是反映方法系統誤差和隨機誤差的總和指標，它決定著這個分析結果的可靠性。準確度用絕對誤差或相對誤差表示。

2.6.1標準樣品分析法

通過分析標準樣品，由所得結果了解分析的準確度。如果標準中有對準確度的判定方式，則按標準的規定，如無，可用下列方式進行判定。

1)CD0.95(臨界差)法[8]

用于測量的標準方法提供有可靠的重復性標準偏差σr和復現性標準偏差σR時，可采用CD值進行評價，標準方法的臨界CD值為式(2)：

(2)

注：r=2.8σr，R=2.8σR

2)En值(又稱歸一化偏差)法[9]

當實驗室能夠對所檢測項目進行正確的不確定度評定時，可使用En值對結果評價，見式(3)。

(3)

當En≤1，則表明實驗室的結果滿意，否則為不滿意。

3)Z值法

在CD0.95值和En值不可獲得時，如相關專業標準規定了測試結果的允許差，可按標準規定評價。計算Z值，見式(4)。

(4)

式中：

Xlab為實驗室測量結果；

Xref為標準品或控制樣品的參考值；

Δ為標準中規定的允許差。

若|Z|≤1，則測試結果為滿意結果，否則為不滿意結果。

4)重復分析標準物質，測定含量平均值與真值的偏差指導范圍見表5[10]。

表5 測定值與真值的偏差指導范圍

2.6.2加標回收率測定法[4,10]

1)在樣品中加入一定量標準物質測其回收率。

按下式計算回收率P：

回收率P/%=(加標試樣測定值-試樣測定值)/加標量×100%

2)進行加標回收時，應注意以下幾點：

(1)加標物質的形態應該和待測物的形態相同；

(2)回收率應在方法測定低限、兩倍方法測定低限和十倍方法測定低限進行三水平試驗；

(3)任何情況下加標量均不得大于待測物含量的3倍(一般取0.5～2倍)；

(4)當樣品中待測物濃度高于校準曲線的中間濃度時，加標量應控制在待測物濃度的半量。

3)回收率的參考范圍見表6[4]：

表6 回收率范圍

2.6.3與已有方法比較法

通常認為，不同原理的分析方法具有相同不準確度的可能性極小，當對同一樣品用不同原理的分析方法測定，并獲得一致的測定結果時，可將其作為真值的最佳估計。

當用不同分析方法對同一樣品進行重復測定時，若所得結果一致，或經統計檢驗標準其差異不顯著時，則可認為這些方法都具有較好的準確度。所得結果呈現顯著性差異，則應以被公認的可靠方法為準。檢驗兩結果是否存在顯著性差異的方法有t值檢驗法、En值法。

1)t值檢驗法

雙整體t檢驗(獨立樣本)是檢驗兩個樣本平均數與其各自所代表的總體差異是否顯著。首先按照F檢驗法檢驗兩樣品的方差是否存在顯著性差異，如無，方可進行t值檢驗。

(1)F值檢驗法

本方法主要用來評價兩組數據的精密度是否存在顯著性差異。

計算步驟：

a.分別計算甲、乙兩組數據的方差(S1)2、(S2)2； b.然后根據F=(S1)2/(S2)2，計算F值；

注：S1應大于S2。

c.查F分布表，F0.05，(n1，n2)

d.F小于F0.05，說明兩組數據的精密度無顯著差異。

(2)檢驗統計量為式(5)：

(5)

其中，

S為兩樣品標準偏差;

n為樣本的個數。

以0.05為顯著性水平，f=n1+n2-2，查t值表，得臨界值t表。如t

2)En法

當實驗室能夠對兩個檢測項目進行正確的不確定度評定時，可使用En值對結果評價。本方法還適用于利用標準物質進行驗證、已知不確定度的兩個實驗室間的比對和留樣再測情況。

計算公式(6)：

(6)

其中，x1是一種方法的測量結果，x2是另一種方法的測量結果，U1是一種方法的實驗室擴展不確定度。U2是另一種方法的實驗室擴展不確定度。

注：①如進行標準物質驗證、實驗室間比對、留樣再測時，則可將x2改成被測物品參考值、另一個實驗室的或上次的測量結果，將U2改成參考值的擴展不確定度、另一個實驗室或本實驗室的擴展不確定度。

②用于實驗室間比對時，當已知參比實驗室的不確定度優于本實驗室，且無法獲取具體不確定度值時，可保守認為與本實驗室該結果的不確定度相等。

③如利用標準物質進行驗證，可假定本實驗室測量結果的不確定度等同于標準物質證書上給定的不確定度，以簡化計算公式。

判定方式：

如En≤1，則表明實驗室的結果滿意，否則為不滿意。

準確度可采用2.6.1—2.6.3中的一種或多種合適的方法進行，匯總情況見表7。

表7 準確度試驗及判定方式匯總表

3 結論

檢測方法的驗證和確認是確保檢測結果準確性和可靠性非常重要的環節，也是實驗室必做的工作之一。只有做好方法的驗證和確認才能確保實驗室具有使用新方法進行檢測的技術能力。但目前如何進行方法驗證和確認卻沒有統一的做法。本文根據實驗室的操作經驗和相關標準要求，闡述了如何進行新引進的標準方法的驗證和非標方法的確認，旨在為廣大化學分析實驗室提供一種切實可行的工作方法，確保實驗室出具的分析結果科學、準確、可靠。