席夫堿多功能金屬離子探針的合成及在生物成像中的應用

曹亞萍 吳 慶 胡慶紅 余光勤 袁澤利

(遵義醫學院藥學院, 遵義 563000)

1 引 言

鈣、銅及鋅是生物體中不可或缺的重要金屬元素，它們在生物體中濃度平衡紊亂會導致諸多疾病的發生[1,2]。如阿爾茲海默病[3]和帕金森病[4]等神經退行性疾病與體內Cu2+的濃度有關；糖尿病[5]、腦缺血[6]、白內障[7]等疾病與Zn2+的濃度有關；骨質疏松等疾病與Ca2+的濃度有關。而這些金屬離子在體內濃度平衡與生物體獲取這些金屬離子來源(如水體、食物及藥品等)密切相關。因此, 監控生物體內、水體及藥品中Ca2+、Cu2+及Zn2+的濃度十分必要。

目前，檢測Ca2+、Cu2+及Zn2+的方法有原子吸收光譜法、紫外-可見吸收光譜法、比色法、滴定分析法和電感耦合質譜法等[8,9]。近年發展起來的化學探針法因其具有靈敏度高、選擇性好、方法簡便和可生物體原位檢測等優點，受到研究者的青睞[10～13]。近年來報道的金屬離子化學探針，如1,8-萘二甲酸酐類[14]、羅丹明類[2]、苯并咪唑類[15]及杯芳烴類[16]等，能對待測的一種或兩種金屬離子具有高選擇性，且可用于實際樣品中。但這些探針的合成步驟復雜，樣品測試多在有機溶體系中進行，限制了它們在生物體內對金屬離子檢測的實際應用[17]。因此，設計合成簡易、能在水相體系中選擇性識別金屬離子，并可應用于生物體內檢測的新化學探針受到極大關注[17,18]。

含亞胺或甲亞胺基團的席夫堿結構因其合成簡單、光電特性優良及金屬離子螯合能力強等特性，可被作為化學探針檢測金屬離子。本課題組在前期通過簡單的的方法合成了系列可在水中進行雙重識別待測物的席夫堿化學探針[19,19]，并用于細胞熒光成像檢測[98,20]。在此基礎上，本研究以2,6-二甲酰基對甲基苯酚為原料，與煙酸酰肼進行一步縮合，得到具有多個N、O配位原子的雙席夫堿探針L(圖 1)。在無水乙醇-Tris-HCl緩沖液(9∶1，V/V, pH 7.40)中，探針L能同時選擇性識別Ca2+、Cu2+及Zn2+，對實際樣品(藥品、水樣、血清)中3種金屬離子含量的測試結果令人滿意。尤為重要的是，探針L能應用于肝癌細胞HepG2、斑馬魚活體及小鼠體內Ca2+的熒光成像檢測。本研究結果表明，所構建的雙席夫堿探針L是一種具有多重識別Ca2+、Cu2+和Zn2+，并可在生物體應用的化學探針。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

Agilent400 MR DD2核磁共振儀、Varian 1000 FT-IR紅外光譜儀、Varian Carry 熒光分光光度計(美國Aglient公司)； Micromass LCT PremierXE 高分辨質譜儀(美國Waters公司); ABSCIEX QTRAP4000 LC-MS/MS質譜儀(美國ABSCIEX公司); TU-1901雙光束紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司); IVIS Lumina XRMS Series Ⅲ 小動物活體成像系統(美國PerkinElmer公司); IX73奧林巴斯倒置熒光顯微鏡(日本奧林巴斯公司)。

煙酸酰肼、4-甲基苯酚等試劑均為分析純，如未特殊說明，使用前均未進行純化處理。實驗用水為超純水(電阻率18.3 MΩ·cm)。2,6-二甲酰基-4-甲基苯酚按本課題組前期方法[13]合成。血清樣品來自于遵義醫學院附屬醫院檢驗科。

2.2 探針L合成方法

探針L的合成線路如圖1所示，于100 mL圓底燒瓶中加入0.33 g (2 mmol)的2,6-二甲酰基-4-甲基苯酚、0.56 g (4 mmol)煙酸酰肼和25 mL無水乙醇，加熱回流3.5 h，冷卻，抽濾，烘干，得淡黃色粉末狀固體，產率72.0%。m.p.: 277～279℃;1H NMR(400 MHz, DMSO-d6)δ(ppm):12.31(s, 2H, NH), 12.24(s, 1H, OH), 9.10(s, 2H, CH=N), 8.79(s, 2H, Ar-H), 8.72(s, 2H, Ar-H), 8.29～8.30(d,J= 6.5 Hz, 2H, Ar-H), 7.60(s, 4H, Ar-H), 2.34(s, 3H, CH3);13C NMR(100 MHz, DMSO-d6)δ(ppm): 161.97, 155.24, 152.87, 149.07, 147.14, 135.96, 128.83, 124.10, 120.23, 20.35; HR-MS(ESI-MS) calcd for C24H25N6O3(M++ H+): 403.1519, found 403.1511; FT-IR (4000～400 cm-1)v: 3464, 3415, 3290, 3201, 2851, 1667, 1618, 1597, 1558,1458, 1400, 1355, 1300, 1270, 1195和756。

圖1 探針L的合成過程示意圖Fig.1 Synthesis of chemsensor probe L

2.3 溶液配制

2.4 紫外-可見吸收光譜和熒光光譜檢測

將探針L及其分別與2.3中所述的陰離子或金屬離子配制成相應濃度的溶液5 mL，測紫外-可見吸收光譜和熒光光譜(狹縫寬度均為5 nm，電壓為中等，λex=337 nm，λem=515 nm)。

2.5 細胞成像實驗

取對數生長期的HepG2細胞懸液 300 μL(5×104cell/mL)于24孔板中，孵育24 h后，加入96 μL 探針L(160 μmol/L)繼續孵育30 min，再加入30 μL 2 mmol/L的Ca2+或Zn2+溶液，繼續孵育30 min后，用PBS輕輕洗滌3次，用奧林巴斯IX73熒光倒置顯微鏡藍色通道(λex=420～485 nm，λem=515 nm)進行細胞成像分析。

2.6 斑馬魚成像測試

將適量L用1 mL DMSO溶解后，以PBS配制成2 mmol/L待測液，取3.5 μL待測液于EP管中，用去離子水定容至1 mL，作為探針對照組；以同樣的取樣量取L至EP管中，再加入100 μL的Ca2+或Zn2+溶液，定容至1 mL，作為實驗組；分別在探針對照組及實驗組中加入1～2條斑馬魚，孵育30 min，于奧林巴斯IX73熒光倒置顯微鏡藍色通道(λex=420～485 nm，λem=515 nm)下觀察成像結果。

2.7 小鼠成像測試

昆明小鼠(SPF級，雄性，5～6 W，34～36 g)購自華中農業大學實驗動物中心，喂養一周后進行實驗；SPF級C57BL/6小黑鼠(雄性，6～8 W，18～22 g)購于華中農業大學，喂養一周進行實驗。取對數生長期的B16F10細胞進行消化、離心，將所得的約5×106個細胞溶于0.1 mL DMEM培養液，注射于C57BL/6 小黑鼠左右后肢背根部皮下。接種后7～9天瘤體長到5～10 mm，此B16F10腫瘤模型小黑鼠可進行后續實驗。

將探針L用乙醇溶解，濃度為2 mmol/L。取300 μL探針L，加入300 μL生理鹽水，作為探針對照組；取300 μL探針L，加入300 μL Ca2+或Zn2+溶液，作為實驗組；用1 mL注射器取100 μL探針對照組溶液，皮下注射到正常昆明小鼠腹部左側，在正常昆明小鼠腹部右側皮下注射實驗組溶液，注射完畢后，在小動物活體成像系統(λex=460 nm，λem=520 nm)中觀察成像結果；取同濃度同劑量的對照溶液皮下注射到B16F10腫瘤模型小黑鼠左側腫瘤部位，在右側腫瘤部位皮下注射實驗組溶液，注射完畢后，利用小動物活體成像系統(λex=460 nm，λem=520 nm)觀察成像結果。

3 結果與討論

3.1 探針L的合成與結構表征

以2,6-二甲酰基-4-甲基苯酚為原料，經與煙酸酰肼縮合反應制得目標探針L。探針L為黃色粉末狀固體，熔點227℃～229℃，易溶于二甲基亞砜(DMSO)、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、甲醇、氯仿、二氯甲烷及乙醇溶劑中。L的結構和組成經1H NMR、13C NMR、HR-MS(ESI-MS)以及FT-IR證實為預期目標分子結構(表征譜圖見電子版文后支持信息圖S1～S4)。

3.2 探針L的識別性能

3.2.1探針L的選擇性在無水乙醇-Tris-HCl緩沖液(9∶1，V/V, pH 7.40)混合溶劑中，研究了探針L對堿金屬離子(Li+、Na+和K+)、堿土金屬離子(Mg2+、Ba2+、Ca2+和Sr2+)、過渡金屬離子(Mn2+、Fe3+、Co2+、Ni2+、Cu2+、Zn2+、Cd2+、Hg2+和Ag+)及Al3+和Pb2+的選擇性(圖2和圖S5)。由紫外-可見吸收光譜(圖2A)可見，未加入Ca2+、Cu2+和Zn2+時，L在301和366 nm處有最大吸收；加入Ca2+后，L在470 nm產生了新的吸收峰；當Cu2+和Zn2+分別加入后，均在335 nm以及405 nm和415 nm產生了新的吸收峰。上述結果表明，3種金屬離子分別與L發生了結合。在相同的條件下，選擇加入18種常見陰離子后，未觀察到探針L的紫外-可見吸收光譜發生任何變化(圖S6)。

在同樣條件下，測試了L與上述金屬離子作用前后的熒光光譜圖(圖2B)。加入Zn2+和Ca2+后，在486和514 nm處的熒光強度分別增加了11倍和9倍，而Al3+的加入也會使486 nm處的熒光強度增加5倍。此外，于365 nm紫外燈照射下，還觀測到Ca2+和Zn2+分別與探針L結合后有綠色的熒光和藍色熒光(圖S7)，Al3+與L混合后，也觀察到較弱的藍色熒光。而加入其余陰離子后，未觀察到探針L的熒光變化(圖S8和S9)。根據上述實驗結果，可用紫外-可見吸收光譜法識別檢測Cu2+，用熒光光譜法識別檢測Zn2+和Ca2+。

圖2 (A)在無水乙醇/Tris-HCl(9∶1, V/V, pH=7.40)緩沖溶液中加入探針L(10 μmol/L)與Ca2+、Cu2+、Zn2+(100 μmol/L)的紫外-可見吸收光譜；(B)在無水乙醇/Tris-HCl(9∶1, V/V, pH=7.40)緩沖溶液中加入L(20 μmol/L)以及各個金屬離子(Li+, Na+, K+, Zn2+, Fe3+, Al3+, Mg2+, Ca2+, Cu2+, Cd2+, Pb2+, Ni2+, Ba2+, Co2+, Mn2+, Sr2+, Hg2+和Ag+)后的熒光光譜。Fig.2 (A) Absorbance spectra of probe L (10 μmol/L) in ethanol/Tris-HCl buffer (9∶1, V/V, pH 7.40) upon individual addition of 100 μmol/L different metal ions. (B) Fluorescence spectra of probe L (20 μmol/L) before and after the addition of various metal ions (40 μmol/L), including Li+, Na+, K+, Zn2+, Fe3+, Al3+, Mg2+, Ca2+, Cu2+, Cd2+, Pb2+, Ni2+, Ba2+, Co2+, Mn3+, Sr2+, Hg2+ and Ag+ in ethanol/Tris-HCl buffer (9∶1, V/V, pH 7.40).

圖3 在探針L (10 μmol/L)的乙醇/Tris-HCl (9∶1, V/V, pH=7.40)緩沖液中加入不同濃度Cu2+ (A) 的紫外-可見吸收光譜圖以及不同濃度Zn2+(B)的熒光光譜圖。Fig.3 UV-Vis absorbance spectra of probe L (10 μmol/L) in the presence of different concentrations of Cu2+ (A), and fluorescence spectra of probe L (10 μmol/L) in the presence of different concentrations of Zn2+(B) in ethanol/Tris-HCl (9∶1, V/V, pH 7.40) buffer.

3.2.2探針L的濃度依賴性為進一步驗證探針L能否用于Ca2+、Cu2+和Zn2+的定量檢測，測定了不同濃度的Cu2+、Zn2+和Ca2+對探針L光譜的影響，結果如圖3和S10所示。由圖3A可知，探針L在301 nm處的吸收峰強度隨Cu2+濃度的增加而逐漸減小，而在366 nm處的吸收峰強度逐漸增加，并逐漸藍移至335 nm。同時，在432 nm處產生新的吸收峰，當Cu2+濃度為10 μmol/L時，吸光度達到最大值；其后，隨著Cu2+濃度增加，吸收峰藍移至406 nm處，當Cu2+濃度增至20 μmol/L，達到最大吸收，Cu2+濃度繼續增加，體系的吸光度變化不大(電子版文后支持信息圖S10)。而在熒光光譜圖中，隨Ca2+濃度的增加，在514 nm有新的吸收峰，且Ca2+濃度達到30 μmol/L后，體系的熒光強度值變化較小。類似地，隨著Zn2+濃度增加，探針L在波長486 nm處的熒光強度逐漸增大，當Zn2+濃度增至30 μmol/L后，體系熒光強度變化趨勢明顯減弱(圖3B)，表明二者之間具有很好的絡合作用。此外，探針L溶液的吸光度或熒光強度與Cu2+、Ca2+和Zn2+的濃度有較好的線性關系, 線性相關系數(R2)分別為0.9990、 0.9929和0.9969(圖S11～S13)，以空白樣品3倍的標準偏差計算檢出限，得探針L對Cu2+、Ca2+和Zn2+的檢出限分別為9.2×10-7mol/L、 9.0×10-7mol/L和5.1×10-7mol/L，表明探針L可以用于定量檢測Cu2+、Ca2+和Zn2+。

3.2.3探針L識別Ca2+、Cu2+和Zn2+的pH范圍和時間響應為了驗證L識別Ca2+、Zn2+和Cu2+的實用性，分別考察了pH值和時間對L識別Ca2+、Cu2+和Zn2+的光譜的影響，結果見圖4和圖S14、S15。由圖可知，探針L與Ca2+在pH=6～8范圍內有識別作用，而探針L與Zn2+則在pH=7～9的范圍內有識別作用。用紫外-可見光譜法測定，探針L可在pH 5～11范圍內對Cu2+進行識別。因此，L可在生理條件下對這3種金屬離子進行識別檢測。

從時間對探針L識別Ca2+、Cu2+和Zn2+光譜的影響可知，探針L均可快速識別上述3種金屬離子。

圖4 (A) pH值和(B)時間對L 識別Zn2+和Ca2+的影響Fig.4 Effect of (A) pH value and (B) raction time on recognition of probe L to Zn2+ and Ca2+

3.2.4探針L識別Ca2+、Cu2+和Zn2+的抗干擾性能為考察probe 識別Cu2+、Ca2+和Zn2+受其余金屬離子干擾性能，將L分別與待測的Cu2+、Ca2+和Zn2+混合物后，再分別加入干擾離子進行競爭性實驗，用紫外-可見吸收光譜法和熒光光譜法進行測定，結果見圖5以及圖S16、S17。由圖5可見，熒光光譜法測定Zn2+會受到同周期的Fe3+、Cu2+、Ni2+、Co2+和Pd2+的干擾外，其余的干擾物未有顯著干擾。可用F-、半胱氨酸、丁二酮肟和I-掩蔽Fe3+、Cu2+、Ni2+和Pd2+對L識別Zn2+的干擾(圖S18～S21)。

圖5 探針L(10 μmol/L)及其與Zn2+(26 μmol/L)在各種金屬離子(26 μmol/L)存在下的熒光強度，以L作對照，λmax= 498 nmFig.5 Relative emission of probe L (10 μmol/L) and its complexation with Zn2+ (26 μmol/L) in the presence of different metal ions (26 μmol/L). The response of probe L on its own is used as a control. λmax= 498 nm

然而，探針L識別Cu2+受到Fe3+、Cd2+和Pb2+微小干擾外，其余金屬離子未見顯著干擾。類似地，探針L識別Ca2+受到Fe3+和Pd2+微小干擾外，其余金屬離子未見顯著干擾。這表明探針L識別Ca2+、Cu2+和Zn2+具有一定的抗干擾能力。

3.3 探針L識別Ca2+、Cu2+和Zn2+的機理

圖6 (A) 探針L在乙醇/Tris-HCl (9∶1, V/V, pH=7.40)緩沖液中加入Zn2+(λmax = 498 nm) 和EDTA的可逆性變化; (B)在356 nm紫外燈下觀察探針L在乙醇/Tris-HCl (9∶1, V/V, pH=7.40)緩沖液中加入Zn2+(λmax = 498 nm) 和EDTA的顏色變化Fig.6 (A) Reversible changes of fluorescence response of probe L following addition of Zn2+ (λmax=498 nm) and EDTA to a mixture of ethanol/Tris-HCl (9∶1, V/V, pH 7.40) buffer. (B) Color change of probe L following addition of Zn2+ (λmax=498 nm) and EDTA to a mixtur of ethanol/Tris-HCl (9∶1, V/V, pH 7.40) buffer under 365 nm UV-Vis light

3.3.1配位作用為驗證L識別Ca2+、Cu2+和Zn2+的機理，向L+M2+(M2+=Ca2+、Cu2+和Zn2+)溶液中加入EDTA，再加入相應M2+離子，如此循環5次的實驗結果如圖6、圖S22和圖S23所示。由圖6A可見，隨著強螯合劑EDTA的加入, EDTA迅速奪取與L配位的M2+, 使參與配位的L重新游離出來，引起吸光度或熒光強度逐漸下降(過程a→b)。當EDTA濃度達到26 μmol/L 時，熒光強度基本不再下降，表明EDTA與Zn2+發生定量配合。再次加入26 μmol/L Zn2+時, 吸光度或熒光強度恢復到原來的大小(過程b→c), 如此繼續重復兩次(c→d, d→e),得到相似的結果,且溶液顏色也發生由綠色的熒光變為無色的重復變化(圖6B)。類似地，EDTA引起L識別Ca2+和Cu2+熒光強度或吸光度也能得到重復變化。上述現結果表明，L是通過配位反應識別Ca2+、Cu2+和Zn2+, 且識別過程可多次重復可逆。

3.3.2配位比鑒于L與M2+(M2+=Ca2+、Cu2+和Zn2+)發生配位作用，將L和M2+的總濃度保持為10 μmol/L，通過改變M2+濃度繪制了探針L分別與3種金屬離子的絡合曲線(圖7(探針L與Ca2+絡合的Job-plot圖)和圖S24、S25)。結果表明, 改變3種金屬離子的摩爾分數, 當Ca2+的摩爾分數為0.5時, 溶液熒光強度達到最大值；當Zn2+和Cu2+的摩爾分數約為0.6時, 溶液的熒光強度或吸光度達到最大值。表明L與Ca2+的絡合比為1∶1，而L與Zn2+和Cu2+的絡合比均為1∶2。

圖7 在探針L的乙醇/Tris-HCl (9∶1, V/V, pH=7.40)緩沖液中L與Ca2+絡合的Job-plot圖Fig.7 Job-plot for Ca2+and probe L showing 1∶1 stoichiometry in ethanol/Tris-HCl (9∶1, V/V, pH 7.40) buffer

3.3.3核磁共振氫譜滴定為進一步證實探針L通過配位作用識別Zn2+，考慮到Zn2+為順磁性，在L的DMSO-d6-D2O(9∶1,V/V)，溶液中滴加不同濃度含Zn2+的DMSO-d6-D2O(9∶1，V/V)溶液，并測試其核磁共振氫譜，結果如圖8所示。探針L結構中的羥基質子(Ha)和酰肼NH質子(Hc)的質子化學位移隨著Zn2+的加入信號逐漸減小，當加入Zn2+與L的物質的量比為2∶1(0.4 mol/L)時，羥基質子(Ha)和酰肼NH質子(Hc)幾乎消失。上述現象表明，L識別Zn2+確實是以配位方式識別的。

圖8 L與Zn2+在DMSO-d6和D2O(9∶1, V/V)中的1H NMR滴定譜圖Fig.8 Partial 1H NMR spectra of ProboL with different concentrations of Zn2+ in DMSO-d6:D2O=9∶1(V/V)

3.4 探針L檢測水樣、血清和藥物中金屬Ca2+、Cu2+和Zn2+

將L應用于藥品(多種微量元素注射液Ⅱ)、水樣(遵義市湘江河水及遵義醫學院自來水)和血清(遵義醫學院附屬醫學院檢驗科血清樣本)樣品中Ca2+、Cu2+和Zn2+含量測定。水樣和血清中Cu2+的回收率見表1；探針L對多種微量元素注射液Ⅱ示值為1.135 mg/mL的Zn2+和Ca2+測定結果均為1.11 mg/mL(n=5)，相對標準偏差(RSD)值均小于5%，說明探針L在測定實際樣品中Ca2+、Zn2+和Cu2+方面有潛在的應用價值。

3.5 探針L應用于Ca2+和Zn2+熒光成像

3.5.1探針L用于活細胞中Ca2+和Zn2+熒光顯微成像為考察探針L用于活細胞中熒光顯微Ca2+和Zn2+成像的可行性，首先采用MTT法考察了探針L對HepG2活細胞存活率影響，結果(圖S26)表明，L對HepG2活細胞具有較低的細胞毒性。進一步研究了L在活細胞中Ca2+和Zn2+熒光顯微成像。由圖9可見，HepG2細胞與L孵育2 h后，未觀察到熒光信號。在同樣條件下，當加入Ca2+或Zn2+，繼續孵育30 min后，在活細胞中觀測到明亮的熒光(圖9G和9H)，表明L具有良好的細胞滲透性，可用于檢測活細胞中的Ca2+和Zn2+。

3.5.2探針L在斑馬魚活體中的Ca2+和Zn2+熒光顯微成像用5天齡斑馬魚幼體進行活體中Ca2+和Zn2+熒光顯微成像。由圖10可見，經斑馬魚活體及斑馬魚和L孵化30 min后，幾乎觀測不到熒光，表明斑馬魚幼體體內Ca2+和Zn2+水平極低。而將經L孵化后的斑馬魚再分別與Ca2+或Zn2+一起孵育后, 在斑馬魚體內觀察到強的熒光，尤以Zn2+在斑馬魚頭部及尾部觀察到熒光最強。 整個成像過程，斑馬魚幼體狀態良好，表明L對斑馬魚的毒性很小，能用于活體中Ca2+和Zn2+熒光成像檢測，尤其是對Zn2+熒光成像檢測更為顯著。

表1L對水樣及血清中Cu2+的加標回收率

Table 1 Recovery of Cu2+in water samples and serum

水樣Sample加入量Added (μmol/L)測得量Found (μmol/L)回收率Recovery (%)RSD(%,n=5)自來水Tap water湘江河水River water4.04.4110.92.98.08.0100.71.412.011.797.51.84.04.5112.53.18.07.999.23.112.012.2102.31.7水樣Sample加入量Added (μmol/L)測得量Found (μmol/L)回收率Recovery (%)RSD(%,n=5)血清Serum4.04.4111.22.58.08.6108.53.812.011.596.33.6

圖9 探針L在HepG2細胞中識別Ca2+或Zn2+的熒光成像圖(A～D) 明場通道成像；(E～F) 藍色熒光通道成像。(A和E)未經任何處理的HepG2細胞；(B和F) HepG2細胞加入探針L后孵育30 min后的成像結果；(C和G) HepG2細胞加入探針L后孵育30 min后再加入Ca2+繼續孵育30 min的成像結果；(D和H) HepG2細胞加入探針L后孵育30 min后再加入Zn2+繼續孵育30 min的成像結果Fig.9 In vitro fluorescence imaging of Ca2+ or Zn2+ in HepG2 cells using probe L (A-D) Bright-field images; (E-F) Fluorescence images in blue channel. (A and E) HepG2 cells without probe L; (B and F) HepG2 cells incubated with probe L for 30 min; (C and G) HepG2 cells incubated with probe L for 30 min, and further incubated with Ca2+ for 30 min; (D and H) HepG2 cells incubated with probe L for 30 min, and further incubated with Zn2+ for 30 min

圖10 探針L在斑馬魚中識別Ca2+或Zn2+的熒光成像圖。(A～D)明場通道；(E～F)藍色熒光通道。(A和E)未經任何處理的斑馬魚；(B和F) 斑馬魚中加入探針L后孵育30 min后的成像結果；(C和G) 斑馬魚中加入探針L后孵育30 min后再加入Ca2+繼續孵育30 min的成像結果；(D和H) 斑馬魚中加入探針L后孵育30 min后再加入Zn2+繼續孵育30 min的成像結果Fig.10 In vivo fluorescence imaging of Ca2+ or Zn2+ in living zebra fishes using probe L (A-D) Bright-field images. (E-F) Fluorescence images in blue channel. (A and E) zebra fishes without probe L; (B and F) zebra fishes incubated with probe L for 30 min; (C and G) zebra fishes incubated with probe L for 30 min, and further incubated with Ca2+ for 30 min; (D and H) zebra fishes incubated with probe L for 30 min, and further incubated with Zn2+ for 30 min

3.5.3探針L用小鼠體內Ca2+和Zn2+熒光成像由圖11可見，空白鼠和皮下注射探針L的小鼠均未觀察到熒光。當在皮下注射探針L后的同一位置注射Ca2+或Zn2+后，隨即觀察到顯著的熒光。整個實驗過程中，小鼠體征未出現異常，且繼續喂養3 d未死亡，表明L對小鼠毒性很小，并能快速地在體內熒光成像檢測Ca2+和Zn2+。

將L用于B16F10腫瘤模型小黑鼠腫瘤組織Ca2+和Zn2+的熒光成像檢測。由圖12可見，空白腫瘤組織(圖12A)和僅注射L的腫瘤組織(圖12B左側腫瘤)未見熒光，當在腫瘤組織注射L并再注射Ca2+或Zn2+后，能觀察到顯著的熒光(圖12B右側腫瘤)。實驗后繼續喂養3天，B16F10腫瘤模型小黑鼠未出現異常或死亡，說明探針L經腫瘤注射后對小鼠毒性小，并能快速地在腫瘤組織內熒光成像檢測Ca2+和Zn2+。

圖11 探針L用小鼠體內Ca2+和Zn2+熒光成像(A)空對照組；(B)左側：皮下組織注射探針L(100 μL, 50 μmol/L), 右側：皮下組織注射探針L(100 μL, 50 μmol/L)，隨后注射Ca2+(100 μL, 50 μmol/L)；(C) 左側：皮下組織注射探針L(100 μL, 50 μmol/L), 右側：皮下組織注射探針L(100 μL, 50 μmol/L)，隨后注射Zn2+ (100 μL, 50 μmol/L)。λex=460 nm, λem=520 nmFig.11 Fluorescence imaging of Ca2+ and Zn2+ in the healthy mice using probe L(A) Control; (B) Left: subcutaneous tissues given an injection of probe L (100 μL, 50 μmol/L). Right: subcutaneous tissues given an injection of probe L (100 μL, 50 μmol/L), and followed by an injection of Ca2+ (100 μL, 50 μmol/L). (C) Left: subcutaneous tissues given an injection of probe L (100 μL, 50 μmol/L). Right: subcutaneous tissues given an injection of probe L (100 μL, 50 μmol/L), and followed by an injection of Zn2+ (100 μL, 50 μmol/L). λex=460 nm, λem=520 nm

圖12 探針L在B16F10腫瘤模型小黑鼠體內Ca2+和Zn2+的熒光成像(A) 左側：在腫瘤組織部位注射探針L(100 μL,50 μmol/L)，右側：在腫瘤組織部位注射探針L(100 μL, 50 μmol/L)，隨后注射Ca2+(100 μL, 50 μmol/L)；(B) 左側：在腫瘤組織部位注射探針L(100 μL, 50 μmol/L)，右側：在腫瘤組織部位注射探針L(100 μL, 50 μmol/L)，隨后注射Zn2+(100 μL, 50 μmol/L)；λex=460 nm, λem=520 nmFig.12 Fluorescence imaging of Ca2+ or Zn2+ in B16F10 cells tumor-bearing mice using probe L(A) Left: tumor tissues given an intra-tumor injection of probe L (100 μL, 50 μmol/L). Right: tumor tissues given an intra-tumor injection of probe L (100 μL, 50 μmol/L), and followed by a intra-tumor injection of Ca2+(100 μL, 50 μmol/L). (B) Left: tumor tissues given an intra-tumor injection of probe L (100 μL, 50 μmol/L). Right: tumor tissues given an intra-tumor injection of probe L (100 μL, 50 μmol/L), and followed by a intra-tumor injection of Zn2+(100 μL, 50 μmol/L). λex=460 nm, λem=520 nm

4 結 論

將2,6-二甲酰基對甲基苯酚與煙酸酰肼在乙醇中簡便一步合成得到具有多個N、O配位原子的雙席夫堿探針L。在無水乙醇-Tris-HCl緩沖液(9∶1，V/V, pH 7.40)中，通過紫外-可見吸收光譜和熒光光譜法研究其對常見18種金屬離子和18種陰離子的識別性能，結果表明, 探針L能同時對Ca2+、Cu2+和Zn2+表現出較高的靈敏度和選擇性。對Ca2+、Cu2+和Zn2+檢出限分別為9.0×10-7mol/L、9.2×10-7mol/L和5.1×10-7mol/L，且L在實際樣品中(藥物、水樣和血清) 對Ca2+、Cu2+和Zn2+離子具有良好的識別效果。此外，探針L還可在HepG2細胞、斑馬魚和活體小鼠中對Ca2+和Zn2+成像檢測。本研究結果對檢測生物活體中金屬離子研究具有重要參考價值。